具有细胞内穿透能力的诱导RNA干扰的核酸分子及用途制造技术

本发明专利技术涉及具有优异的靶基因抑制效率且无需另外的细胞载体而具有细胞内穿透能力的新型结构的核酸分子以及利用其的靶基因的表达抑制方法，所述核酸分子具有诱导RNAi的双链核酸分子所含的至少一个核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯取代且结合有亲油性化合物的结构。本发明专利技术的核酸分子结构同时引入了胆固醇修饰和硫代磷酸酯修饰，可维持优异的基因抑制效率的同时无需另外的细胞载体也可具有细胞内穿透能力，且能够以充分诱导RNAi的量传递到实际靶标部位上，可解决以往技术中存在的体内传递问题。本发明专利技术的核酸分子可代替以往的siRNA分子而有效利用于使用siRNA的癌或病毒感染治疗等，对所述癌或病毒感染治疗等方面有用。

Nucleic acid molecules that induce intracellular RNA interference and their uses

The present invention relates to a novel structure of nucleic acid molecules with excellent target gene inhibition efficiency and without another cell carrier with the ability of intracellular penetration and the expression inhibition method using its target gene. The nucleic acid molecule has the phosphoric acid skeleton of at least one nucleotides contained in the double stranded nucleic acid molecule of RNAi. A structure substituted by phosphate or two thiosulfate and combined with a lipophilic compound. The nucleic acid molecular structure of the present invention also introduces cholesterol modification and thiosphosphate modification, which can maintain excellent gene inhibition efficiency without the need of another cell carrier and have intracellular penetration ability, and can transmit the amount of RNAi to the actual target position fully, and can solve the existing body in the previous technology. Internal transmission problem. The nucleic acid molecule of the present invention can be effectively used in the use of siRNA for cancer or virus infection in place of previous siRNA molecules, and is useful for the treatment of the cancer or virus infection.

【技术实现步骤摘要】
具有细胞内穿透能力的诱导RNA干扰的核酸分子及用途本申请是申请日为2013年5月21日、申请号为201380038984.6、专利技术名称为“具有细胞内穿透能力的诱导RNA干扰的核酸分子及其用途”的申请的分案申请。
本专利技术涉及一种新型结构的具有细胞内穿透能力的RNAi诱导核酸分子及其用途，更具体地说，涉及一种具有优异的靶基因抑制效率且无需另外的细胞载体而具有细胞内穿透能力的新型结构的核酸分子以及利用该核酸分子的靶基因的表达抑制方法，所述核酸分子具有诱导RNAi的双链核酸分子中含有的至少一个核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯(Phosphorothioate)或者二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)取代且结合有亲油性化合物(lipophiliccompound)的结构。
技术介绍
RNA干扰(RNAinterference：RNAi)是非常特异的能够有效抑制基因表达的机制，该机制在细胞等中导入双链RNA(dsRNA)而诱导靶基因mRNA的分解，由此抑制靶基因的表达，其中，所述双链RNA(dsRNA)由具有与靶基因的mRNA同源序列的正义链和具有与靶基因的mRNA互补序列的反义链构成。诱导这样的RNA干扰的siRNA是碱基序列能够特异性地抑制靶标基因表达的短长度(19～21bp)的双链RNA，因为其具有高效率性和靶标特异性，因此目前作为难以治疗的癌、病毒的感染以及遗传病等各种疾病的治疗剂备受关注。在利用siRNA的有效的治疗剂开发方面，还存在稳定性、沉默效率(silencingefficiency)、免疫反应、脱靶效应(off-targeteffects)等各种需解决的问题，其中体内(invivo)的有效传递(delivery)成为最难以解决的问题而被指出。siRNA因为磷酸骨架(phosphatebackbone)结构而带有高的负电荷(negativecharge)，由此无法通过细胞膜，且因为其小的尺寸而在血液(blood)中快速地被去除，由此难以传递充分量的siRNA以在实际靶标部位上实施RNAi诱导。目前，针对体外释药(invitrodelivery)开发出很多利用阳离子脂质体(cationiclipids)和阳离子聚合物(cationicpolymers)的高效传递(delivery)方法(SioudM，SorensenDRCationicliposome-mediateddeliveryofsiRNAsinadultmice.BiochemBiophysResCommun2003；312：1220-1225)。但是，大部分情况下，在体内(invivo)无法如体外(invitro)那样高效率地传递siRNA，由于与生物体内存在的各种蛋白质发生相互作用(interaction)，因此存在siRNA的传递效率变弱的问题(Bolcato-BelleminAL，BonnetME，CreusatG，etal.StickyoverhangsenhancesiRNA-mediatedgenesilencing.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2007；104：16050-16055)。另外，根据传递载体(deliveryvehicle)的组成，与发生疾病的部位无关地会在肝或肺等特定脏器中高浓度地蓄积，因此还存在诱发毒性的问题。一方面，已知结缔组织生长因子(Connectivetisssuefrowthfactor，CTGF/CCN2)作为基质细胞蛋白(metricellularprotein)的一种，其在细胞的分化、生长、迁移(migration)、ECM生成(ECMproduction)、附着(adhesion)等方面起到重要的作用。在各种脏器中诱导纤维化(fibrosis)而损坏脏器功能的慢性纤维化疾病(chronicfibroticdisorders)的情况下，确认到引起纤维化疾病(fibroticdisorder)的组织中CTGF被过表达，在皮肤的情况下已较好地研究出CTGF和纤维化(fibrosis)的关系。正常皮肤中CTGF表达被抑制成正常水平(basallevel)，但在发生创伤的情况下，则观察到CTGF的表达暂时性地增加。与此相对，瘢痕瘤(keloid)或硬化症(localizedsclerosis)的情况下，在创伤治愈之后CTFG的过表达仍然持续，利用反义(antisense)等抑制CTGF的表达时纤维化(fibrosis)以及瘢痕瘤(keloid)的生成被抑制，由此确认到CTGF在纤维化(fibrosis)以及肥厚性瘢痕的生成起到重要的作用(SiscoM，KrygerZB，O'ShaughnessyKD，etal.Antisenseinhibitionofconnectivetissuegrowthfactor(CTGF/CCN2)mRNAlimitshypertrophicscarringwithoutaffectingwoundhealinginvivo.WoundRepairRegen2008；16：661-673.DOI：WRR416[pii])。在病理学方面，报告有全长CTGF分子与存在结缔组织细胞的过度增殖以及细胞外基质的过度沉积的状态相关联。本领域中还记载有：CTGF与血管内皮细胞移动、增殖以及血管新生相关的状态相关联。作为与这些状态相关的疾病以及障碍，可例举：皮肤以及主要器官的纤维症、癌，以及系统性硬化病、血管生成、动脉粥样硬化症、糖尿性肾病以及肾性高血压等相关疾病、障碍。另外，还报告有：CTGF对创伤治愈、结缔组织恢复、骨以及软骨恢复等方面也有用。对于上述内容，已公开有CTGF作为骨、组织或者软骨生成的诱导因子在骨质疏松症、骨关节炎或者骨软骨炎、关节炎、骨骼疾病、肥厚性瘢痕、烧伤、血管性肥大症或者声音(sound)治愈等方面起到作用(例如，参考文献(美国专利第5，837，258号))。为此，本专利技术人等为了提供可在体外(invitro)以及体内(invivo)实施有效传递的具有朝向细胞内的穿透能力的新型结构的诱导RNAi的核酸分子而进行悉心研究的结果发现：诱导RNAi的双链核酸分子中含有的至少一种核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯(Phosphorothioate)取代并结合(conjugation)亲油性化合物(lipophiliccompound)时，该核酸即使在体内(invivo)也无需另外的细胞载体而具有优异的靶基因抑制效率并同时具有优异的细胞内穿透能力，从而完成了本专利技术。该
技术介绍
部分中记载的上述内容仅用于加深理解本专利技术的背景，对于本专利技术所属的
的技术人员来说，可能未包含构成已知现有技术的内容。现有技术文献专利文献专利文献1：美国专利第5，837，258号。非专利文献非专利文献1：SioudM，SorensenDRCationicliposome-mediateddeliveryofsiRNAsinadultmice.BiochemBiophysResCommun2003；312：1220-1225。非专利文献2：Bolcato-Bellem本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RNAi诱导用双链核酸分子，包含：长度为19～121nt的第一链，其包含与靶核酸互补区域，并且包含至少一个硫代磷酸酯键或者二硫代磷酸酯键和至少一个2’‑O‑Me修饰的核苷酸；和长度为13～21nt的第二链，其互补地结合至所述第一链的与所述靶核酸互补的区域，并且包含至少一个硫代磷酸酯键或者二硫代磷酸酯键和至少一个2’‑O‑Me修饰的核苷酸，并且还包含与所述第二链的3’末端共价连接的胆固醇部分；其中，所述第二链结合至所述第一链，从而所述第一链具有与所述第二链结合的双链区域和不与所述第二链结合的单链区域，并且其中，所述第一链的5’末端和所述第二链的3’末端形成钝端。

【技术特征摘要】
2012.05.22 KR 10-2012-00539501.一种RNAi诱导用双链核酸分子，包含：长度为19～121nt的第一链，其包含与靶核酸互补区域，并且包含至少一个硫代磷酸酯键或者二硫代磷酸酯键和至少一个2’-O-Me修饰的核苷酸；和长度为13～21nt的第二链，其互补地结合至所述第一链的与所述靶核酸互补的区域，并且包含至少一个硫代磷酸酯键或者二硫代磷酸酯键和至少一个2’-O-Me修饰的核苷酸，并且还包含与所述第二链的3’末端共价连接的胆固醇部分；其中，所述第二链结合至所述第一链，从而所述第一链具有与所述第二链结合的双链区域和不与所述第二链结合的单链区域，并且其中，所述第一链的5’末端和所述第二链的3’末端形成钝端。2.如权利要求1所述的核酸分子，其中，所述第一链的长度是24～121nt。3.如权利要求1所述的核酸分子，其中，所述第一链的长度是19～31nt。4.如权利要求1所述的核酸分子，其中，所述第一链包含1至48个硫代磷酸酯键或者二硫代磷酸酯键。5.如权利要求2所述的核酸分子，其中，所述第一链包含1至31个硫代磷酸酯键或者二硫代磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：弘善宇，
申请(专利权)人：奥利克斯医药有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国,KR