用于增强基因沉默的药物组合物和方法技术

在各种方面和实施方案中，本发明专利技术提供增强siRNA细胞进入或活性的化合物或药剂，并且提供用于识别此类化合物或药剂的方法。本文中描述充当L‑型钙通道阻断剂的示例性药剂并且显示其与cp‑asiRNA一起增强基因沉默。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增强基因沉默的药物组合物和方法
本申请要求2016年6月29日提交的韩国专利申请号KR10-2016-0081914的优先权，所述韩国专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。本专利技术提供增强siRNA细胞进入或活性的化合物或药剂。本专利技术进一步提供识别此类化合物或药剂的方法。
技术介绍
RNA干扰(RNAi)能够以高特异性及有效的方式抑制基因表达。通过将双链RNA引入细胞中，RNAi导致目标mRNA的降解，所述双链RNA包含具有与目标基因的mRNA同源的序列的有义链和具有与目标基因的mRNA互补的序列的反义链。为开发基于siRNA的有效治疗剂，必须克服与例如稳定性、细胞进入和沉默效率有关的技术障碍。例如，因为由于磷酸酯骨架结构的负电荷，siRNA不能通过细胞膜，所以体内递送的有效性受到挑战。尽管在体外递送的情况下，存在许多采用阳离子脂质和阳离子聚合物以加强细胞穿透的试剂，但这些试剂不适合在治疗背景下使用。需要用于改良或增强siRNA活性的药物组合物和方法，包括加强siRNA细胞进入的组合物以推进这个有前途的技术。
技术实现思路
在各种方面和实施方案中，本专利技术提供增强siRNA细胞进入或活性的化合物或药剂。本专利技术进一步提供识别此类药剂的方法。本文中描述充当L-型钙通道阻断剂的示例性药剂且表明其增强siRNA的细胞进入。一方面，本公开提供包含诸如细胞穿透不对称小干扰RNA(cp-asiRNA)的siRNA和L-型钙通道阻断剂的药物组合物。所述L-型钙通道阻断剂加强siRNA的细胞穿透，引起更有效的基因沉默。在一些实施方案中，所述L-型钙通道阻断剂为二氢吡啶或非二氢吡啶L-型钙通道阻断剂。所述药物组合物可以被配制用于各种递送途径，包括局部递送、肺部递送和肠胃外递送以用于治疗方法中。在其他方面中，本公开提供一种在受试者中基因沉默的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的小干扰RNA(siRNA)和L-型钙通道阻断剂。所述siRNA和所述L-型钙通道阻断剂可以作为单一药物组合物被施用，或在一些实施方案中，所述siRNA和所述L-型钙通道阻断剂作为单独的药物组合物被施用。在一些实施方案中，所述siRNA为不对称siRNA(asiRNA)，诸如细胞穿透asiRNA(cp-asiRNA)或长反义asiRNA(lasiRNA)。所述L-型钙通道阻断剂可以为二氢吡啶L-型钙通道阻断剂或非二氢吡啶L-型钙通道阻断剂。在各种实施方案中，siRNA和L-型钙通道阻断剂中的一者或两者被配制用于局部递送、肺部递送或肠胃外递送。另一方面，本公开提供一种筛选化合物以改良诸如细胞穿透不对称小干扰RNA(cp-asiRNA)或长反义asiRNA(lasiRNA)的siRNA的细胞进入或基因沉默活性的方法。所述方法可以包括使siRNA与细胞接触；和使候选化合物与所述细胞接触；以及检测或定量所述细胞中的siRNA，或在一些实施方案中，定量目标RNA的表达的减少。通过将siRNA穿透或活性与对照进行比较，可以识别加强或增强siRNA活性或细胞进入的化合物或药剂，可选地被衍生化并且配制为药物组合物。在一些实施方案中，可以高通量筛选出增强活性的化合物。在额外实施方案中，所述方法还包括选择增加siRNA(例如asiRNA，例如cp-asiRNA或lasiRNA)的细胞穿透或活性的候选化合物。这些化合物可以与siRNA一起配制，或分开配制，且递送给病患以增强siRNA的基因沉默活性。附图说明图1描绘高通量筛选的示例性方案。图(A)：高通量筛选策略的概要。图(B)：高通量筛选和命中化合物的结果。图2说明通过由筛选识别的3种命中化合物对cp-asiRNA的加强的基因沉默功效。图(A)：由3种命中化合物验证加强的基因沉默效能。图(B)：进一步分析西尼地平(cilnidipine)的加强的基因沉默效能。图表中的所有数据表示3次独立实验的平均值±SD。图3说明DHP(二氢吡啶)L-型钙通道阻断剂的作用。图(A)：分析由衍生自DHPL-型钙通道阻断剂的氨氯地平(Amlodipine)引起的基因沉默活性。图(B)：基于Nucleocounter(NC-3000)定量由DHPL-型钙通道阻断剂引起的细胞摄取。图表中的所有数据表示3次独立实验的平均值±SD。图4说明由非DHPL-型钙通道阻断剂对cp-asiRNA的基因沉默功效。图表中的所有数据表示3次独立实验的平均值±SD。图5说明L-型钙通道阻断剂与T-型钙通道阻断剂的比较。图(A)：使用定量实时逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析的相对mRNA水平。图(B)：与L-型钙通道阻断剂相比，基于Nucleocounter(NC-3000)定量由T-型钙通道阻断剂引起的细胞摄取。图表中的所有数据表示3次独立实验的平均值±SD。图6显示L-型钙通道阻断剂对cplasiRNA的基因沉默功效。通过浓缩将cp-lasiCTGF(0.01μM、0.03μM、0.1μM)与氨氯地平和西尼地平一起处理进希拉(HeLa)细胞中。24小时后，使用定量实时逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析相对mRNA水平。通过除以GAPDH水平(内部对照)测量CTGFmRNA水平。具体实施方式除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本专利技术所属领域技术人员通常理解相同的含义。本文中提及的所有专利和公布均以引用的方式整体并入本文中。本公开提供用siRNA增强基因沉默的组合物和方法，以及通过化合物筛选制备此类组合物的方法。如本文所公开，L-型钙通道阻断剂增强包括cp-asiRNA或lasiRNA的siRNA的摄取。一方面，本公开提供包含诸如细胞穿透不对称小干扰RNA(cp-asiRNA)或长反义asiRNA(lasiRNA)的siRNA；和L-型钙通道阻断剂的药物组合物。如本文所使用，术语“RNAi”(RNA干扰)指的是将双链RNA(dsRNA)引入细胞中以诱发目标mRNA降解的机制，所述双链RNA(dsRNA)包含具有与目标基因的mRNA互补的序列的第一链和具有与第一链互补的序列的第二链。第一链可以为反义链，其指的是与目标mRNA大体上，即约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补的多核苷酸。例如，反义链可以与mRNA(信使RNA)的分子、非mRNA的RNA序列(例如微RNA、piwiRNA、tRNA、rRNA和hnRNA)或编码或非编码的DNA序列完全或部分互补。术语“反义链”与“引导链”在本文中可互换使用。在各种实施方案中，第一链通常具有约16至约50个核苷酸，诸如约16、17、18、19、20、21、22、23、24和25个核苷酸的长度。在第一链中，与目标核酸互补的区域可以具有约16至约31个核苷酸、约19至约25个核苷酸或约19至约21个核苷酸的长度。另外，第二链可以为有义链，其指的是具有与目标核酸完全或部分相同的核苷酸序列的多核苷酸。第二链可以具有约13至约25个核苷酸、约13至约21个核苷酸或约16至约21个核苷酸的长度。在各种实施方案中，第二链可以具有约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种药物组合物，所述药物组合物包含小干扰RNA(siRNA)和L‑型钙通道阻断剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.29 KR 10-2016-00819141.一种药物组合物，所述药物组合物包含小干扰RNA(siRNA)和L-型钙通道阻断剂。2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述siRNA为不对称siRNA(asiRNA)。3.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述siRNA为细胞穿透asiRNA(cp-asiRNA)或长反义asiRNA(lasiRNA)。4.如权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述L-型钙通道阻断剂为二氢吡啶L-型钙通道阻断剂。5.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述二氢吡啶L-型钙通道阻断剂选自氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、伊拉地平、依福地平、非洛地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平和普拉地平。6.如权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述L-型钙通道阻断剂为非二氢吡啶L-型钙通道阻断剂。7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述非二氢吡啶L-型钙通道阻断剂选自(i)苯基烷胺钙通道阻断剂和苯并硫氮杂钙通道阻断剂；(ii)加巴喷丁类似物，包括加巴喷丁和普瑞巴林；(iii)齐考诺肽；以及(iv)米贝拉地尔、苄普地尔、氟桂利嗪和氟司必林。8.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述L-型钙通道阻断剂选自维拉帕米、地尔硫、加洛帕米和芬地林。9.如权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于局部递送、肺部递送或肠胃外递送。10.如权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中所述siRNA包含具有与编码CTGF的mRNA的序列互补性的反义链。11.如权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中所述siRNA包含具有与MyD88mRNA序列或TLRmRNA序列的序列互补性的反义链。12.如权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中所述siRNA包含具有与编码酪氨酸酶的mRNA序列的序列互补性的反义链。13.一种在受试者中基因沉默的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的小干扰RNA(siRNA)和L-型钙通道阻断剂。14.如权利要求13所述的方法，其中所述siRNA和所述L-型钙通道阻断剂作为单一药物组合物被施用。15.如权利要求13所述的方法，其中所述siRNA和所述L-型钙通道阻断剂作为单独的药物组合物被施用。16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述siRNA为不对称siRNA(asiRNA)。17.如权利要求16所述的方法，其中所述siRNA为细胞穿透asiRNA(cp-asiRNA)或长反义asiRNA(lasiRNA)。18.如权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述L-型钙通道阻断剂为二氢吡啶L-型钙通道阻断剂。19.如权利要求18所述的方法，其中所述二氢吡啶L-型钙通道阻断剂选自氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、伊拉地平、依福地平、非洛地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平和普拉地平。20.如权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述L-型钙通道阻断剂为非二氢吡啶L-型钙通道阻断剂。21.如权利要求20所述的方法，其中所述非二氢吡啶L-型钙通道阻断剂选自(i)苯基烷胺钙通道阻断剂和苯并硫氮杂钙通道阻断剂；(ii)加巴喷丁类似物，包括加巴喷丁和普瑞巴林；(iii)齐考诺肽；以及(iv)米贝拉地尔、苄普地尔、氟桂利嗪和氟司必林。22.如权利要求21所述的方法，其中所述L-型钙通道阻断剂选自维拉帕米、地尔硫、加洛...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·李，D·S·孙，Y·H·金，
申请(专利权)人：奥利克斯医药有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国,KR