食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法技术

本发明专利技术公开一种食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法，其包括以下步骤：选取健康的饲养食蟹猴；麻醉食蟹猴之后，显露腹部内的右肾门，理顺出右肾静脉、右肾动脉和右侧输尿管；显露第一肝门，理顺出门静脉、肝动脉和胆总管；结扎所述右肾动脉和右肾静脉的近右肾门端，自右肾静脉的远右肾门端向心插入流转管至下腔静脉内并固定；结扎并离断所述胆总管，结扎所述门静脉的近肝脏端，门静脉的远肝脏端自门静脉的近心端向远心端插入所述流转管的另一端并固定；使所述流转管内充盈血液之后，闭合所述腹部继续饲养。本发明专利技术操作简便，成功率高，造模效果理想，所建立的急性肝功能衰竭模型能够很好地用于人工肝支持系统的安全性和有效性的临床前评估。

Construction method of cynomolgus monkey acute liver failure model

The present invention discloses a method for constructing an acute liver failure model of cynomolgus macaque, which includes the following steps: selecting healthy feeding crynus monkeys, anaesthetized cynomolgus monkeys, exposing the right renal portal in the abdomen, straightening out the right renal vein, right renal artery and right ureter, exposing the first hepatic portal, and straightening out the outside, the hepatic artery and the hepatic artery. Ligation of the right renal artery and the near right renal portal of the right renal vein was ligated and inserted into the inferior vena cava from the distal right renal portal from the right renal vein to the inferior vena cava; ligated and disconnected from the common bile duct, ligated the proximal hepatic end of the portal vein, and the distal liver of the portal vein inserted from the proximal end of the portal vein to the distal end of the portal vein. The other end of the flow tube is fixed, so that the said abdominal cavity is filled with blood, and the abdomen is closed to keep feeding. The invention has the advantages of simple operation, high success rate and ideal model effect. The established model of acute liver failure can be well used for the safety and effectiveness of the artificial liver support system.

【技术实现步骤摘要】
食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法
本专利技术涉及一种动物模型的构建方法，尤其涉及一种食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法。
技术介绍
急性肝功能衰竭(ALF)是指无基础肝病史的患者2周以内出现以Ⅱ度以上肝性脑病为特征的肝衰竭临床表现，起病急，病程短，预后差，文献报道病死率高达80％。目前，原位肝移植是临床治疗急性肝功能衰竭的有效手段，但供体有限、费用昂贵等因素，极大地限制了肝移植手术的推广和普及。近年来，体外人工肝支持系统(ALSS)的出现为挽救肝功能衰竭患者的生命带来了希望。ALSS可分为非生物人工肝和生物人工肝。目前研究较多且最具前景的是生物人工肝。生物人工肝是利用培养的生物活性成分(肝细胞)置于体外生物反应器中，患者血液或血浆流过生物反应器，通过半透膜或直接接触与反应器内培养的肝细胞进行物质交换，为肝功能衰竭患者提供肝脏支持功能。各种类型的生物人工肝研究都离不开体外肝支持的动物实验，合适的动物模型是其性能评价和进一步临床应用的重要条件。目前，建立急性肝衰竭动物模型的方法主要包括药物法和手术法。药物法制备的ALF动物模型优点是操作简单方便，无需麻醉，但是，由于动物不同个体之间以及同一动物在不同条件下对药物的耐受能力和代谢情况差异较大，故所制备的模型稳定性稍差，主要表现在生化指标的改变，病理组织学的改变以及死亡率和生存时间上均变化较大。手术制备ALF动物模型仍然是目前较多的造模方法，尤其是大动物的ALF模型。目前，外科手术模型主要包括肝切除模型和急性肝缺血模型(肝血流阻断模型)，前者包括全肝切除模型和部分肝切除模型，全不可逆性、治疗窗窄、手术操作要求高、病理变化与临床不相符合等缺点；部分肝切除尚未有统一的标准。因此，急性肝缺血模型成为外科模型中最多见的模型。急性肝缺血模型制备最常用的方法是门腔静脉吻合术(PCA)加肝动脉结扎术(HAL)。该方法多数情况下需分期手术阻断入肝血流，操作繁琐且难度相对较大，同时动物生存时间较短，不能完全满足人工肝等实验的治疗时间窗。因此，有必要建立一种操作简单，重复性强和稳定性好的急性肝功能衰竭模型制备的方法。食蟹猴属于非人灵长类动物，在亲缘关系上和人最接近，在组织结构、免疫、生理和生化和代谢等方面和人类高度相似，是极其珍贵的实验动物，其应用价值远远超过其他种属的实验动物，是急性肝功能衰竭和生物人工肝向临床过渡研究中最理想的动物模型。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服现有技术的不足，提供一种操作简单，重复性强和稳定性好的食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法。为达到以上技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法，其包括以下步骤：选取健康的饲养食蟹猴；麻醉食蟹猴之后，显露腹部内的右肾门，理顺出右肾静脉、右肾动脉和右侧输尿管；显露第一肝门，理顺出门静脉、肝动脉和胆总管；结扎所述右肾动脉和右肾静脉的近右肾门端，自右肾静脉的远右肾门端向心插入流转管至下腔静脉内并固定；结扎并离断所述胆总管，结扎所述门静脉的近肝脏端，门静脉的远肝脏端自门静脉的近心端向远心端插入所述流转管的另一端并固定；使所述流转管内充盈血液之后，闭合所述腹部继续饲养。优选地，所述食蟹猴为7～11岁龄，体重为8～10kg。进一步优选地，所述食蟹猴麻醉所使用的药物包括替来他明、唑拉西泮、阿托品以及异氟烷和氧气的混合气体。更优选地，所述流转管采用直径为0.5cm的PVC胶管。具体地，所述插入下腔静脉的流转管长0.5～1.0cm。进一步具体地，所述插入门静脉的流转管长1.5～2.0cm。优选地，所述流转管在使用前管腔内预充125U/ml的肝素生理盐水。进一步优选地，所述继续饲养的时间为10d。进一步地，还包括在显露腹部前、闭合腹部后和继续饲养过程中对所述食蟹猴进行血氨、肝功能、肾功能及凝血功能的检测。更进一步地，还包括对所述继续饲养的食蟹猴的肝组织进行病理学鉴定的步骤。与现有技术相比较，本专利技术具有如下优势：本专利技术食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法操作简便，重复性好，推广性强，无需二次开腹操作，创伤小，成功率高，实验动物死亡率低，造模效果理想，是一种稳定可靠的急性肝功能衰竭模型，所建立的急性肝功能衰竭模型能够很好地用于人工肝支持系统的安全性和有效性的临床前评估。附图说明图1是食蟹猴术前麻醉示意图；图2是截取自一次性使用无菌输血器和PVC胶管(PVC-GC)为PVC胶管；图3是本专利技术食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法中显露、解剖右肾门示意图(RRV为右肾静脉；RRA为右肾动脉；RU为右侧输尿管；SBV为小分支静脉；IVC为下腔静脉；L为肝脏；RK为右侧肾脏)；图4是本专利技术食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法中显露、解剖第一肝门示意图(CBD为胆总管；PV为门静脉；L为肝脏；GB为胆囊)；图5是食蟹猴术前麻醉示意图；(RRV为右肾静脉；RU为右侧输尿管；IVC为下腔静脉；CBD为胆总管；PV为门静脉；L为肝脏；RK为右侧肾脏；GB为胆囊；PVC-GC为PVC胶管)；图6是术后食蟹猴出现嗜睡和明显黄疸(身目、尿液变黄)示意图；图7是食蟹猴肝功生化、肾功和凝血(Ammonia，ALB，TBiL，DBiL，ALT，AST，ALP，CK，LDH，Cr，BUN)术前术后不同时间点变化情况示意图(基础值baseline，术后0h，8h，1d，2d，3d，7d和10d)；图8是食蟹猴术前正常肝脏病理组织检查示意图；图9是食蟹猴术后肝脏病理组织检查示意图。具体实施方式为了可以使本专业技术人员更全面地理解本专利技术，以下结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细描述。(1)实验动物的选择：所选实验动物为健康食蟹猴，雌雄不限，7～11岁龄，体重8～10kg，饲养符合标准动物饲养条件。(2)造模手术：1)麻醉和术中监测准备：实验猴采用静脉和气体联合麻醉，具体操作过程：先肌肉注射Zoletil50(替来他明125mg+唑拉西泮125mg)(15mg/kg)和阿托品(0.5mg/kg)实施基础麻醉，待动物摇晃倒地，肌肉松弛，眼睑反射迟钝时予以捉持。将实验猴仰卧位置于铺有保温电热毯的手术床上，经口明视行气管插管，衔接吸入式麻醉机，先吸入2～3％的异氟烷和氧气(2L/min)混合气体，诱导麻醉完成后再将异氟烷浓度调至1-2％以维持术中麻醉。取颈内静脉建立术中静脉输液通路并监测术中中心静脉压；用6Fr儿童型导尿管行导尿术，准确监测并记录术中实验猴尿量；术中行连续肢体导联心电态监测：肢体导联从左到右、从上到下按红、黄、蓝、黑标记将电极与连接。以Ⅱ导联的波形作为分析判断指标(如图1所示)；2)手术步骤：麻醉满意后，固定四肢及头部，所有手术步骤严格遵循无菌操作原则，电动剃毛刀剔除腹毛备皮，常规方法消毒、铺无菌巾；戴口罩和手术帽，穿无菌手术衣，戴无菌手套，取剑突下、脐上腹部正中纵行手术切口逐层进腹，探查肝脏大小、质地、色泽正常后，取小块肝脏组织，分别用10％福尔马林固定，留样作病理学检查组织学对照；如图2所示，取长约12cm，直径为0.5cm的PVC胶管作为转流管，管腔内预冲肝素生理盐水(125U/ml)；如图3所示，显露并解剖右肾门，游离右肾静脉、右肾动脉、及右侧输尿管，结扎右肾动脉，右肾静脉近肾门端结扎，远端向心插管至下腔静内0.5c本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：选取健康的饲养食蟹猴；麻醉食蟹猴之后，显露腹部内的右肾门，理顺出右肾静脉、右肾动脉和右侧输尿管；显露第一肝门，理顺出门静脉、肝动脉和胆总管；结扎所述右肾动脉和右肾静脉的近右肾门端，自右肾静脉的远右肾门端向心插入流转管至下腔静脉内并固定；结扎并离断所述胆总管，结扎所述门静脉的近肝脏端，门静脉的远肝脏端自门静脉的近心端向远心端插入所述流转管的另一端并固定；使所述流转管内充盈血液之后，闭合所述腹部继续饲养。

【技术特征摘要】
1.一种食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：选取健康的饲养食蟹猴；麻醉食蟹猴之后，显露腹部内的右肾门，理顺出右肾静脉、右肾动脉和右侧输尿管；显露第一肝门，理顺出门静脉、肝动脉和胆总管；结扎所述右肾动脉和右肾静脉的近右肾门端，自右肾静脉的远右肾门端向心插入流转管至下腔静脉内并固定；结扎并离断所述胆总管，结扎所述门静脉的近肝脏端，门静脉的远肝脏端自门静脉的近心端向远心端插入所述流转管的另一端并固定；使所述流转管内充盈血液之后，闭合所述腹部继续饲养。2.如权利要求1所述的食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法，其特征在于，所述食蟹猴为7～11岁龄，体重为8～10kg。3.如权利要求1所述的食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法，其特征在于，所述食蟹猴麻醉所使用的药物包括替来他明、唑拉西泮、阿托品以及异氟烷和氧气的混合气体。4.如权利要求1所述的食蟹猴急性肝功能衰竭模型的构建方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：高毅，蔡磊，冯磊，翁骏，张斌斌，刘钊远，韩旭，
申请(专利权)人：广东乾晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44