食蟹猴急性肝衰模型的建立方法技术

本发明专利技术涉及一种食蟹猴急性肝衰模型的建立方法，所述方法包括经食蟹猴颈外静脉注射Ｄ－氨基半乳糖的步骤。通过食蟹猴颈外静脉注射Ｄ－氨基半乳糖溶液，以实验手段诱导出食蟹猴的急性肝功能衰竭，建立的急性肝衰模型能够很好地用于生物人工肝系统的安全性和有效性的临床前评价。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及急性肝衰动物模型的建立方法，具体涉及利用食蟹猴建立急性肝衰模型的方法。
技术介绍
急性肝功能衰竭(acute liver failure，ALF)是指原来不存在肝硬化的患者26 周内出现凝血异常和不同程度的意识改变，其病程短、预后极差，有报道显示病死率高达 80%。目前，唯一有效的治疗方法是原位肝移植。然而，目前因为器官短缺，有三分之一的 急性肝衰患者在等待器官移植的过程中死亡。作为急性肝功能衰竭患者肝移植或肝再生的 桥梁，人工肝支持系统是非常必要的。人工肝支持系统已被国内外学者证明具有良好的临床治疗效果。人工肝支持系统 可以分为非生物人工肝支持系统和生物人工肝支持系统，其中最有发展前景的是生物人工 肝支持系统。生物人工肝是利用培养的生物活性成分(肝细胞)置于体外生物反应器中， 患者血液/血浆流过生物反应器，通过半透膜或直接接触与培养肝细胞进行物质交换，为 肝功能衰竭患者提供肝脏支持功能。在生物人工肝的研究中，为评价生物人工肝的安全性 和有效性，稳定的急性肝功能衰竭模型的建立是必不可少的。然而，目前没有一种已建立的动物模型能够适应这种要求。因此，有必要提供一种 急性肝衰动物模型，以满足科学研究的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种，所述方法包括经食 蟹猴颈外静脉注射D-氨基半乳糖的步骤。在本专利技术的实施方式中，所述D-氨基半乳糖为0. lg/ml的D-氨基半乳糖的葡萄 糖溶液的形式。在优选的实施方式中，所述D-氨基半乳糖的葡萄糖溶液的pH为6. 8。在本专利技术的另一实施方式中，所述D-氨基半乳糖的葡萄糖溶液在10分钟内被注 射完毕。在本专利技术的另一实施方式中，所述D-氨基半乳糖以0. 3g/kg体重的剂量被注射进 入食蟹猴。在本专利技术的另一实施方式中，在注射之前，在颈外侧中段且与颈外静脉垂直处作 2 3cm的横切口，切开皮肤皮下组织，结扎出血点，并用弯血管钳沿静脉方向分离皮肤组 织，将静脉游离1.5 2cm。由D-氨基半乳糖导致大量肝细胞坏死所诱导的急性肝功能衰竭过程被认为是最 接近人的急性肝衰竭病程。本专利技术提供的，是通过食蟹猴 颈外静脉注射D-氨基半乳糖溶液，以导致大量肝细胞坏死，建立食蟹猴急性肝衰模型。根 据该模型，对不同的食蟹猴进行分析对比，实际试验结果表明，通过颈外静脉注射D-氨基 半乳糖溶液后，食蟹猴出现了一些与肝功能下降相关的临床表现，如食欲下降、活动减少、恶心呕吐、嗜睡以及昏迷，最终死于肝功能衰竭，生化检测、死亡后的尸体解剖及光镜、电镜 病理学改变也证实了这一实验结果，从而说明本专利技术以实验手段建立了食蟹猴急性肝衰模 型，该模型能够很好地用于生物人工肝系统的安全性和有效性的临床前评价。附图说明图1-3分别为本专利技术实施例1中食蟹猴的肝脏、肾脏和脑部切片在光镜下观察到 的图片；图4-6分别为本专利技术实施例1中食蟹猴的肝脏、肾脏和脑部切片在电镜下观察到 的图片；图7-9分别为本专利技术实施例2中食蟹猴的肝脏、肾脏和脑部切片在光镜下观察到 的图片；图10-12分别为本专利技术实施例2中食蟹猴的肝脏、肾脏和脑部切片在电镜下观察 到的图片。具体实施例方式以下将结合具体实验来阐述本专利技术的具体实施方法以及本专利技术的优点。研究表明，D-氨基半乳糖是一种肝细胞毒性药物，可在短时间内引起严重肝损害， 其作用机制是①通过抑制肝细胞的RNA和浆膜蛋白合成造成肝细胞坏死；②肝细胞坏死 与细胞外Ca 2+大量进入细胞内有关；③肠外因素，包括胃肠通透性增加，细菌的移位和内 毒素等都增加了 D-氨基半乳糖的肝脏毒性。大动物模型是医疗新产品开发的必需资料。在生物人工肝进行大动物肝功能衰竭 的实验治疗过程中，大动物的血浆将与人的肝细胞直接接触，这可能诱发动物抗人的免疫 反应；考虑到降低免疫因素的需要，本专利技术采用灵长类食蟹猴为模型动物。灵长类动物是目 前最理想的临床前实验数据来源，在形态结构、组织结构、免疫、生理和代谢等方面与人类 高度近似的优点，但开展并不广泛，数据资料比较稀缺。食蟹猴肝功能衰竭模型的建立目前 尚未有成熟的方法，也尚未有利用生物人工肝进行救治的研究报道。从临床表现、血液生化 指标、组织学改变等各个生理病理方面模拟人类的急性肝功能衰竭过程，将有利于我们探 讨生物人工肝治疗急性肝衰竭的方法，有利于评价生物人工肝的安全性和有效性，这不仅 有重要的理论价值，也有着潜在的应用前景。本专利技术的方法具体包括以下步骤(1)准备材料本专利技术所选用的动物为食蟹猴，雄性，7岁龄，体重6 7kg。(2) D_氨基半乳糖溶液的配制称取D-氨基半乳糖盐酸盐(药物纯度为98%)溶于5%的葡萄糖溶液中，配制药 物的浓度为lg/10ml，用lmol/L的NaOH调节溶液的pH值为6. 8。(3)暴露颈外静脉麻醉后于颈外侧中段且与颈外静脉垂直处作2-3cm的横切口，切开皮肤皮下组 织，结扎出血点，用弯血管钳沿静脉方向分离皮肤组织，将静脉游离1. 5-2cm。(4)给药吸取已配制好的D-氨基半乳糖溶液，接上头皮针，准确地把头皮针插进颈外静 脉，回抽注射器见回血后将头皮针与颈外静脉结扎在一起，lOmin内按0. 3g/kg的剂量把 D-氨基半乳糖溶液经颈外静脉一次性输入食蟹猴体内。(5)给药后的观察项目记录给药后食蟹猴的生存情况和生存时间，生化指标和死亡后的尸体解剖及光 镜、电镜病理学改变。实施例11材料与方法1. 1材料选取成年食蟹猴，雄性，7岁龄，体重6. 7kg，未曾用于其他实验，单笼饲 养，水和食物不限。1. 2 方法1. 2. 1D-氨基半乳糖溶液的配制称取D-氨基半乳糖盐酸盐(药物纯度为98 % ) 溶于5%的葡萄糖溶液中，配制药物的浓度为lg/10ml，用lmol/L的NaOH调节溶液的pH值 为6. 8 (pH值用数字pH计测定)，配好的溶液在2h内应用，在lOmin内经颈外静脉插管一次 性输入动物体内。1. 2. 2ALF模型的建立实验猴术前禁食12h，不禁水。采用速眠新II (0. lmL/kg) 肌内注射和氯胺酮(0. lml/kg)肌内注射联合麻醉方法麻醉猴，平卧位并妥善固定，用 2. 5-3%的碘酒，75%的酒精消毒局部皮肤，并铺好无菌小孔巾，于颈外侧中段且与颈外静 脉垂直处作2-3cm的横切口，切开皮肤皮下组织，结扎出血点。用弯血管钳沿静脉方向分离 皮肤组织，将静脉游离1. 5-2cm。从游离静脉深面穿过2根1号丝线，暂时不结扎，留作牵引 用。吸取已配制好的D-氨基半乳糖溶液，接上头皮针，并将液体灌满管腔内。左手提起静 脉远心端的1号丝线，右手准确地把头皮针插进颈外静脉，回抽注射器见回血后收紧近心 端的丝线，将头皮针与颈外静脉结扎在一起。在lOmin内把20. lml D-氨基半乳糖溶液经 颈外静脉一次性输入实验猴体内，完成后拔出头皮针，结扎颈外静脉。检查无出血后间断缝 合皮肤切口。实验猴术后给予常规的水果及饲料，没有使用其他的支持治疗和其他药物。1. 3观察项目1. 3. 1术后观察生存情况1. 3. 2生存时间从给药时开始记录动物的存活时间1. 3. 3生化指标术前及术后每天定时抽血，用于测定肝功能、肾功能、血氨、凝血 项、支链氨基酸和芳香族氨基酸比等。1. 3. 4尸检及病理检查动物死后作详细尸检并取肝脏、肾本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种食蟹猴急性肝衰模型的建立方法，所述方法包括经食蟹猴颈外静脉注射Ｄ－氨基半乳糖的步骤。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：简国登，潘明新，高毅，张志，高森，周焕城，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]