制造膜联蛋白V的方法技术

本发明专利技术提供一种用于从具有细胞壁的内毒素产生宿主细胞中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达的细胞内蛋白质的方法，其中所述方法包括从宿主细胞中释放细胞内蛋白质，其特征在于：在包含非离子洗涤剂的匀化缓冲液的存在下执行释放细胞内AnxA5蛋白的步骤，并且优选地，其中所述方法不包括从宿主细胞中释放AnxA5蛋白之后回收和/或提纯AnxA5蛋白的任何离心步骤，并且/或者其中AnxA5蛋白除暂时地与任何色谱树脂时结合之外，在整个方法中保留在溶液中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制造膜联蛋白V的方法
本申请涉及用于生产包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的蛋白质的方法。更具体地，所述方法用于AnxA5蛋白的回收和/或提纯，特别是从重组宿主细胞(如细菌宿主细胞)中。本文中所描述的方法是非常高效且具成本效益的，并且可以用于工业规模(例如，使用具有约1000L或以上的培养体积的重组宿主细胞培养物)从而快速且方便地生产医药级AnxA5蛋白产物。
技术介绍
在本说明书中明显在先发表文件的列表或论述不应必须看作是承认该文件是现有技术水平的部分或者是公知常识。动脉粥样硬化性血栓形成(形成于潜在动脉粥样硬化斑块上)是大多数临床上显而易见的缺血性心血管疾病(包括急性冠状动脉疾病、脑血管和周围动脉闭塞)的关键致病机制。如在Cederholm和Frostegard，2007，《药物新闻与视点(DrugNewsPerspect.)》，20(5):321-6中所描述，膜联蛋白A5(以前被称为膜联蛋白V，是膜联蛋白超家族中的一员)是具有强大且独特抗血栓特性的蛋白质。由膜联蛋白A5所产生的抗血栓作用被认为主要是由于对磷脂类(尤其是磷脂酰丝氨酸)的结构屏蔽来减少它们对凝固反应的可利用性而导致本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从具有细胞壁的内毒素产生宿主细胞中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达细胞内蛋白质的方法，其中所述方法包括从所述宿主细胞中释放所述细胞内蛋白质，其特征在于，释放所述细胞内AnxA5蛋白的步骤在包含非离子洗涤剂的匀化缓冲液的存在下执行，并且优选地，其中所述方法不包括从所述宿主细胞中释放所述AnxA5蛋白之后回收和/或提纯所述AnxA5蛋白的任何离心步骤，并且/或者其中所述AnxA5蛋白除暂时地与任何色谱树脂结合外，在整个方法中保留在溶液中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.17 GB 1516516.01.一种从具有细胞壁的内毒素产生宿主细胞中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达细胞内蛋白质的方法，其中所述方法包括从所述宿主细胞中释放所述细胞内蛋白质，其特征在于，释放所述细胞内AnxA5蛋白的步骤在包含非离子洗涤剂的匀化缓冲液的存在下执行，并且优选地，其中所述方法不包括从所述宿主细胞中释放所述AnxA5蛋白之后回收和/或提纯所述AnxA5蛋白的任何离心步骤，并且/或者其中所述AnxA5蛋白除暂时地与任何色谱树脂结合外，在整个方法中保留在溶液中。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子洗涤剂是聚山梨醇酯，优选选自吐温20和吐温80的聚山梨醇酯，最优选吐温80。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中释放所述细胞内AnxA5蛋白的步骤在匀化缓冲液的存在下执行，所述匀化缓冲液包含有效地减少或防止膜联蛋白A5与内毒素之间结合的量的非离子洗涤剂。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中释放所述细胞内AnxA5蛋白的步骤在匀化缓冲液的存在下执行，所述匀化缓冲液包含0.01至10％(w/w)非离子洗涤剂，如0.02至5％(w/w)、0.05至2％(w/w)或约1％(w/w)非离子洗涤剂。5.根据前述权利要求中任一项所述的从具有细胞壁的宿主细胞中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达细胞内蛋白质的方法，其中所述方法包括从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白，其中在从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白时或者在从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白之后，但在任何进一步的色谱提纯进行之前，所述匀化缓冲液中的游离钙离子浓度低于10mM，优选低于5mM、1mM，更优选低于500μM，或者基本上为零，并且/或者其中所述匀化缓冲液包含钙金属离子螯合剂，或者在释放所述细胞内AnxA5蛋白之后被改性而包含钙金属离子螯合剂。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂选自EDTA或其盐、EGTA或其盐，且最优选EDTA。7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述游离钙离子的水平和/或钙金属离子螯合剂的量有效地降低或防止膜联蛋白A5与所述宿主细胞的细胞壁成分之间的结合。8.根据权利要求5到7中任一项所述的方法，其中所述匀化缓冲液包含或者被调节(在释放所述AnxA5蛋白之前或之后)而包含0.01至500mM，例如0.05至100mM、0.5至20mM、1至15mM、2至10mM或约4mM钙金属离子螯合剂，并且优选地，其中所述钙金属离子螯合剂是EDTA。9.根据权利要求5、6、7或8所述的方法，其中根据权利要求2、3或4中任一项所述的方法，所述匀化缓冲液包含非离子洗涤剂。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂是EDTA。11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述非离子洗涤剂是吐温80。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包含从所述宿主细胞的培养物中回收和/或提纯重组表达的细胞内AnxA5蛋白，并且其中所述培养物具有至少100L、500L、1,000L、5,000L或10,000L的体积。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括按每mL匀化缓冲液约10g生物质的浓度将来自所述宿主细胞培养物的生物质混合于所述匀化缓冲液中的步骤。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述匀化缓冲液中从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白的步骤包括对所述宿主细胞进行溶解、破裂、匀化、超声处理或压力处理，使得所述宿主细胞的细胞壁和细胞膜屏障破裂，并由此释放出细胞内AnxA5蛋白，并且任选地，其中此步骤不包括渗透压冲击和/或冻结-解冻步骤的采用。15.根据权利要求14所述的方法，其中从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白的所述步骤包括高压匀化，如在约400巴和约2,500巴之间的一个或多个循环的高压匀化，优选约600巴的三次匀化循环或约800巴的两次匀化循环。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中释放所述细胞内AnxA5蛋白的所述步骤形成包含所述释放的AnxA5蛋白的生物质匀浆。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述生物质匀浆还包含选自由以下组成的群组的杂质中的一种或多种(通常是全部)：宿主细胞蛋白、宿主细胞壁成分、宿主细胞膜、宿主细胞核酸以及内毒素。18.根据权利要求16或17所述的方法，其还包括以下步骤：澄清所述生物质匀浆，并由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的澄清化产物。19.根据权利要求18所述的方法，其中澄清所述生物质匀浆的步骤包括利用核酸酶，如核酸酶A，优选来自粘质沙雷菌(Serratiamarescens)的核酸酶A对所述匀浆进行处理，并且任选地，其中在释放所述细胞内AnxA5蛋白之前将所述核酸酶包含在所述匀化缓冲液中。20.根据权利要求18或19所述的方法，其中澄清所述生物质匀浆的步骤包括(优选在根据权利要求18或19所述的核酸酶处理之后)使包含所述释放的AnxA5蛋白的所述生物质匀浆通过过滤器(如纤维素或聚丙烯过滤器，优选地，其中所述过滤器是深度过滤器，并且/或者优选地，其中所述过滤器具有小于4μM的截止值)的步骤，并且其中所述过滤器流出物是包含所述释放的AnxA5蛋白的所述澄清化产物。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：使所述释放的AnxA5蛋白经过阴离子交换树脂以便执行第一阴离子交换步骤，并由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物。22.根据权利要求21所述的方法，其中使根据权利要求20所述的方法所产生的包含所述释放的AnxA5蛋白的所述澄清化产物经历所述第一阴离子交换步骤，由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物。23.根据权利要求21或22所述的方法，其中在所述第一阴离子交换步骤之前，对所述释放的AnxA5蛋白的环境的一个或多个参数进行调节，所述参数选自由以下组成的群组：pH、电导率、钙离子螯合剂的水平以及非离子洗涤剂的水平。24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中在约6.9的pH值、约2.8mS/cm的电导率、约1mM的钙离子螯合剂浓度下，对经历所述阴离子交换步骤的所述释放的AnxA5蛋白进行配制，并且利用非离子洗涤剂稀释，例如以获得0.01至1％(w/v)，更优选约0.1％(w/v)的最终非离子洗涤剂浓度。25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述nxA5蛋白在所述阴离子交换步骤期间结合，并且为了释放所述结合的AnxA5蛋白，将清洗溶液和/或洗脱缓冲液施加到所述阴离子交换树脂中，产生了包含所述释放的AnxA5蛋白的所述第一阴离子交换产物，任选地，其中所述洗脱缓冲液包含NaCl，例如约300mM的NaCl。26.一种用于从包含膜联蛋白A5(AnxA5)和一种或多种杂质的溶液中回收和/或提纯包含所述AnxA5蛋白序列的蛋白质的方法，所述方法包括：使包含所述AnxA5蛋白和一种或多种杂质的所述溶液经过阴离子交换树脂，以便执行第一阴离子交换步骤，并由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物；和使所述第一阴离子交换产物直接地或间接地经历亲和色谱步骤，由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物；并且优选地，其中所述AnxA5蛋白在整个所述方法中，包括任何之前或之后的步骤，除暂时地与任何色谱树脂结合时外，均保留在溶液中。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述亲和色谱步骤包括使所述AnxA5蛋白与固定化肝素结合，并且其中利用钙离子的存在促进所述结合。28.根据权利要求27所述的方法，其中利用含有钙离子螯合剂，如EDTA的洗脱缓冲液将所述AnxA5蛋白从所述固定化肝素中洗脱出。29.一种用于从包含膜联蛋白A5(AnxA5)蛋白和一种或多种杂质的溶液中回收和/或提纯包括所述AnxA5蛋白序列的蛋白质的方法，所述方法包括：在吐温80存在下(优选地在0.1％吐温80存在下)使包含所述AnxA5蛋白和一种或多种杂质的所述溶液经历肝素亲和色谱步骤，由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物；并且优选地，其中所述AnxA5蛋白在整个所述方法中，包括任何之前或之后的步骤，除暂时地与任何色谱树脂结合外，均保留在溶液中。30.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：使所述释放的AnxA5蛋白经历亲和色谱步骤，由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物。31.根据权利要求30所述的方法，其中使根据权利要求21至25中任一项所述的方法所产生的所述第一阴离子交换产物中的AnxA5蛋白经历所述亲和色谱步骤。32.根据权利要求31所述的方法，其包括以下步骤，其中：(a)利用根据权利要求18、19或20中任一项所述的方法澄清根据权利要求16或17的包含所述释放的AnxA5蛋白的生物质匀浆，并由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的澄清化产物，以及(b)根据权利要求21至25中的任一项，使所述澄清化产物中的所述AnxA5蛋白经过阴离子交换树脂，以便执行第一阴离子交换步骤，并由此产生包含所述AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物，以及(c)其中根据权利要求30或31，使所述第一阴离子交换产物中的所述AnxA5蛋白经历亲和色谱步骤。33.根据权利要求30至32中任一项所述的的方法，其中所述亲和色谱步骤包括使所述AnxA5蛋白与固定化肝素结合，并且任选地，其中利用钙离子的存在促进所述结合。34.根据权利要求33所述的方法，其中利用含有钙离子螯合剂，如EDTA的洗脱缓冲液将所述AnxA5蛋白从所述固定化肝素中洗脱出。35.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述第一亲和色谱产物包含所述释放的AnxA5蛋白和钙离子螯合剂，如EDTA或EGTA，其任选地在0.1至500mM的范围内，更优选约10mM。36.一种用于从包含膜联蛋白A5(AnxA5)和钙金属离子螯合剂的组合物中回收和/或提纯包含所述AnxA5蛋白序列的蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括使所述组合物经历阴离子交换树脂，以便执行阴离子交换步骤，并由此从所述组合物中回收和/或提纯所述AnxA5蛋白；并且其特征还在于，所述阴离子交换步骤是在另外选择的金属离子存在下执行，其中对所述另外选择的金属离子进行选择，以使得所述钙金属离子螯合剂对所述所选择金属离子的结合亲和力大于其对所述阴离子交换树脂的结合亲和力，但小于其对钙离子的结合亲和力；并且优选地，其中所述AnxA5蛋白在整个所述方法中，包括任何之前的或之后的步骤，除暂时地与任何色谱树脂结合外，均保留在溶液中。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂选自EDTA或其盐、EGTA或其盐，且最优选EDTA。38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂过量存在于所述组合物中，且/或以约或至少0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM或更大的浓度存在于所述组合物中。39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述所选择金属离子是二价阳离子，例如Mg2+离子。40.根据权利要求36至39中任一项所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·莫克斯，扬·克里斯托弗·赖希，
申请(专利权)人：安尼欣制药有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE