本发明专利技术涉及能够紧密地和特异地结合凝溶胶蛋白的新的DNA适体。本发明专利技术进一步涉及使用这些适体来估计给定的样品中凝溶胶蛋白水平和纯化大量的无标签凝溶胶蛋白及其变体。因此，与通过体外PCR合成DNA分子相反，本发明专利技术避免使用不同动物/它们的组织来生产凝溶胶蛋白结合蛋白的、远远更加昂贵的和社会上不接受的方法。使用该策略，可以以远远更低的成本进行凝溶胶蛋白结合基质的大量生产。而且，适体可以用来阻止凝溶胶蛋白结合于其结合配偶体以用于诊断和/或治疗应用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化和定量凝溶胶蛋白及其变体的适体
本专利技术涉及能够以高亲和力特异地结合于凝溶胶蛋白的新的DNA适体和利用这些适体的这种特性估计给定的样品中的凝溶胶蛋白水平和纯化大量的无标签凝溶胶蛋白及其变体。目前，样品中凝溶胶蛋白水平的估计利用肌动蛋白作为凝溶胶蛋白结合蛋白或利用抗凝溶胶蛋白抗体。肌动蛋白主要从兔或鸡肌肉组织中提取。相似地，抗体生产也涉及哺乳动物细胞培养或动物(包括兔、小鼠、山羊、美洲驼、马、母鸡等)的使用。因此，本专利技术尝试使用小DNA分子诊断和纯化血浆凝溶胶蛋白水平；从而避免使用不同动物/它们的组织来生产凝溶胶蛋白结合蛋白，与通过体外PCR合成DNA分子相反，这是远远更加昂贵的和社会上不可接受的方法。这些适体可以化学合成和/或使用PCR以生物化学方式产生和/或通过细菌使用简单的分子生物学工具和方案产生。使用该策略，可以以远远更低的成本进行凝溶胶蛋白结合基质的大量生产。
技术介绍
和现有技术描述凝溶胶蛋白是六个域(G1-G6)的多功能肌动蛋白组装调节蛋白。它以三种同种型存在于人体内，包括两种胞浆同种型和一种分泌至血浆的胞外同种型。所有这些同种型由位于人9号染色体上的单个基因编码。胞浆凝溶胶蛋白的主要功能涉及肌动蛋白的解聚作用以及由钙、pH和磷酸肌醇调节的成核作用(Ashish等人，2007；Garg等人，2011；Peddada等人，2013)。为了启动聚合，它结合于两个球状肌动蛋白单体(G-肌动蛋白)，为了影响肌动蛋白解聚功能，它结合于丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)，通过使肌动蛋白单体之间的非共价键弱化来切断丝和保持作为帽连接于丝的刺端(barbedend)，以防止后续的伸长(Yin和Stull，1999)。在血浆中，凝溶胶蛋白主要涉及快速切断和移去由死细胞释放至血流中的肌动蛋白丝。因此，血浆凝溶胶蛋白[pGSN]通过清除由于细胞坏死释放于血液中的毒性循环丝状肌动蛋白起到保护性作用(Lee和Galbraith，1992)。另外，血浆凝溶胶蛋白还具有结合于体内各种促炎和生物活性分子(包括溶血磷脂酸、1-磷酸鞘氨醇、纤连蛋白和血小板活化因子)的能力，所述各种促炎和生物活性分子充当许多生理功能(包括创伤愈合、神经发育、癌症进展和血管生成)的介质(Bucki等人，2010；Lind和Janmey，1984；Lind等人，1988；Osborn等人，2007)。已经表明pGSN因此隔绝了炎症的这些生物介质，并且使炎性反应和免疫反应定位于损伤部位。除了这些生物活性分子以外，pGSN具有结合于分别属于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细菌表面脂质、脂磷壁酸(LTA)和脂多糖(LPS)的能力(Bucki等人，2008；Bucki等人，2005)。该相互作用减弱LTA和LPS在宿主中介导固有免疫应答的能力(Bucki等人，2008)。人血浆凝溶胶蛋白以～200μg/ml的浓度在血液中循环(Osborn等人，2008)。在动物模型以及具有各种疾病的患者中已经很好地说明了该蛋白的临床意义和治疗重要性。在各种疾病或健康并发症中记录了血浆凝溶胶蛋白水平的显著降低(20～50％)，所述疾病或健康并发症包括从重度到轻度的创伤、烧伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤、急性肝损伤、外科手术、败血症、肝炎、疟疾、MODS(包括心肌梗塞、败血性休克和肌坏死)、异体干细胞移植和多发性硬化(Peddada等人，2012)。而且，已经在从疾病中恢复的患者中发现血浆凝溶胶蛋白水平提高。此外，已经证实补充外源重组凝溶胶蛋白显著提高了不同急性损伤的动物模型的存活率(Lee等人，2007)。基本上，目的在于研究pGSN水平与健康问题严重性以及临床结果的相关性的所有这些研究说明：1)在由于外科手术、炎症或感染而引起的细胞损伤之后，pGSN水平下降，并且这种下降与细胞损伤的程度良好相关，2)下降至临界水平以下的pGSN水平大大提高了死亡风险，因此基于入院时的pGSN水平，对具有严重低pGSN水平的患者可以施用外源凝溶胶蛋白以改善他们的生存机会。因此，pGSN拥有做为用于多种健康病症的优秀的预后生物标记物以及用于改善患者健康状态的治疗相关蛋白的巨大潜能。然而，如果不知道健康个体以及患者的确切血浆凝溶胶蛋白水平，那么凝溶胶蛋白替代疗法不能成为现实。现存的用于估计给定的样品中的凝溶胶蛋白水平的商用试剂盒使用夹心ELISA[酶联免疫吸附测定]的方法。简单来说，将凝溶胶蛋白特异性抗体包被在ELISA板上，然后使用它们与标准样品和测试样品中存在的凝溶胶蛋白结合。然后，通过使用生物素标记的抗凝溶胶蛋白抗体和链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物检测结合的凝溶胶蛋白。然而，所有这些试剂盒仅用于研究用途，而不用于诊断目的。总之，可以概括的是，直到现在，文献中不存在负担得起的、准确的和快速的、可以可靠地用于确定人和其他动物的血浆凝溶胶蛋白水平的诊断方法。考虑到出现的对测量不同疾病或应激条件中的血浆凝溶胶蛋白水平和注射外源凝溶胶蛋白和/或它的变体以改善患者状况的治疗潜能的需求，适体在定量和纯化凝溶胶蛋白及其变体中的作用保持了大的翻译潜能，并且到目前还没有被报道。专利技术目的因此，本专利技术的主要目的是提供展示凝溶胶蛋白结合特性的新的和特异性的DNA适体，所述DNA适体用于开发定量和/或纯化凝溶胶蛋白及其变体的方案。本专利技术的另一个目的是提供通过使用新专利技术的DNA适体及其修饰的变体估计样品中的凝溶胶蛋白水平的方法。本专利技术的再一个目的是提供用于估计样品中凝溶胶蛋白水平的诊断试剂盒。本专利技术的又一个目的是提供用于开发/产生用于纯化凝溶胶蛋白及其变体(包括无标签的变体)的亲和基质的新的DNA适体及其修饰的变体。本专利技术的进一步的目的是提供一种方法，凭借该方法要求保护的DNA适体可以特异性地和紧密地结合于凝溶胶蛋白，从而阻断凝溶胶蛋白结合其他蛋白的能力。
技术实现思路
本专利技术涉及用于估计给定的样品中的凝溶胶蛋白水平，以及纯化有标签的或无标签的凝溶胶蛋白及其变体的凝溶胶蛋白结合DNA适体的鉴定和利用。为了克服用于制备凝溶胶蛋白鉴定试剂盒或方案的抗体和肌动蛋白的样品中批次之间变化的限制，筛选随机DNA适体文库以鉴定能够结合凝溶胶蛋白[NCBI参考序列：NP_000168.1](SEQIDNO：1)或其N末端半部分和C末端半部分(也就是G1-G3和G4-G6(分别为SEQIDNO：2和3))的适体。通过PCR合成寡核苷酸[适体]，将其纯化，以及实验地测试它们结合凝溶胶蛋白及其变体的能力。结果表明某些DNA适体以与抗凝溶胶蛋白抗体(IgG或IgY)和肌动蛋白相当的特异性和敏感性结合凝溶胶蛋白及其变体。该过程的高点(highpoint)是通过PCR方案可以容易地产生DNA适体以及可以以高纯度提取DNA适体。而且，可以高精度地调节比蛋白相对更稳定的DNA适体的浓度。该特征证明在使用DNA适体作为凝溶胶蛋白诊断试剂盒中的包被和结合物质和/或产生亲和基质以大量纯化无标签凝溶胶蛋白及其变体方面是有益的。考虑到出现的对测量不同疾病或应激条件中的血浆凝溶胶蛋白水平和注射外源凝溶胶蛋白和/或它的变体以改善患者状况的治疗潜能的需求，适体在定量和纯化凝溶胶蛋白及其变体中的作用保持了大的翻译潜能，并且到目前还没有被报道本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型DNA适体，其由SEQ ID No.6至9表示。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.07 IN 2852/DEL/20141.一种新型DNA适体，其由SEQIDNo.6至9表示。2.如权利要求1所述的DNA适体，能够结合由SEQIDNo.1表示的凝溶胶蛋白或由SEQIDNo.2和3表示的所述凝溶胶蛋白的变体。3.如权利要求1所述的DNA适体，用于定量样品中的凝溶胶蛋白水平。4.一种使用如权利要求1所述的适体定量样品中的凝溶胶蛋白的方法，其中，步骤包括：[a]在4℃的温度下，使用pH9.2的100mMNaHCO3缓冲液在支持物上包被1μg链霉亲和素10～12小时；[b]用PBS洗涤步骤[a]的包被的支持物，并且用3％BSA的PBS溶液封闭2小时，然后用PBS洗涤；[c]在室温下，使用pH8的补充了2MNaCl的TE缓冲液在步骤[b]的支持物上固定2μM生物素标记的选自SEQIDNo.6至9的适体2小时；[d]用含有0.1％吐温-20的PBS洗涤步骤[c]的包被的支持物两次；[e]将0.2μM～5nM的凝溶胶蛋白或稀释于含有0.1％BSA的选择缓冲液中的样品添加至步骤[d]的支持物中，并使所述支持物静置2小时；[f]用含有0.1％吐温-20的PBS洗涤步骤[e]的包被的支持物4次，然后添加抗凝溶胶蛋白抗体，并且在4℃下温育10～12小时；[g]用含有0.1％吐温-20的PBS洗涤步骤[f]中获得的支持物4次，然后添加与辣根过氧化物酶缀合的二抗，并且温育1小时，然后添加辣根过氧化物酶底物；[h]在显示蓝色后，用2MH2SO4终止步骤[g]的反应，测量在450nm处的吸光度，以确定所述样品中存在的凝溶胶蛋白的量。5.一种使用如权利要求1所述的适体定量样品中的凝溶胶蛋白的方法，其中，步骤包括：[a]在4℃的温度下，使用pH9.2的100mMNaHCO3缓冲液在支持物上包被抗凝溶胶蛋白抗体10～12小时；[b]用PBS洗涤步骤[a]的包被的支持物，并且用3％BSA的PBS溶液封闭2小时，然后用PBS洗涤；[c]将0.2μM～5nM的凝溶胶蛋白或稀释于含有0.1％BSA和0.01％吐温-20的PBS中的样品添加至步骤[b]...
【专利技术属性】
技术研发人员：阿希什，雷努·加吉，纳格什·佩达达，
申请(专利权)人：印度科学工业研究所，
类型：发明
国别省市：印度,IN
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