制造膜联蛋白V的方法技术

本发明专利技术提供一种用于从具有细胞壁的内毒素产生宿主细胞中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达的细胞内蛋白质的方法，其中所述方法包括从宿主细胞中释放细胞内蛋白质，其特征在于：在包含非离子洗涤剂的匀化缓冲液的存在下执行释放细胞内AnxA5蛋白的步骤，并且优选地，其中所述方法不包括从宿主细胞中释放AnxA5蛋白之后回收和/或提纯AnxA5蛋白的任何离心步骤，并且/或者其中AnxA5蛋白除暂时地与任何色谱树脂时结合之外，在整个方法中保留在溶液中。法中保留在溶液中。[转续页]

【技术实现步骤摘要】
制造膜联蛋白V的方法
[0001]本申请是国际申请号PCT/EP2016/072066，国际申请日2016年9月16日，中国申请号No.201680053679.8，专利技术名称为“制造膜联蛋白V的方法”的专利申请的分案申请。


[0002]本申请涉及用于生产包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的蛋白质的方法。更具体地，所述方法用于AnxA5蛋白的回收和/或提纯，特别是从重组宿主细胞(如细菌宿主细胞)中。本文中所描述的方法是非常高效且具成本效益的，并且可以用于工业规模(例如，使用具有约1000L或以上的培养体积的重组宿主细胞培养物)从而快速且方便地生产医药级AnxA5蛋白产物。

技术介绍

[0003]在本说明书中明显在先发表文件的列表或论述不应必须看作是承认该文件是现有技术水平的部分或者是公知常识。
[0004]动脉粥样硬化性血栓形成(形成于潜在动脉粥样硬化斑块上)是大多数临床上显而易见的缺血性心血管疾病(包括急性冠状动脉疾病、脑血管和周围动脉闭塞)的关键致病机制。如在Cederholm和Frostegard，2007，《药物新闻与视点(Drug News Perspect.)》，20(5)：321
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6中所描述，膜联蛋白A5(以前被称为膜联蛋白V，是膜联蛋白超家族中的一员)是具有强大且独特抗血栓特性的蛋白质。由膜联蛋白A5所产生的抗血栓作用被认为主要是由于对磷脂类(尤其是磷脂酰丝氨酸)的结构屏蔽来减少它们对凝固反应的可利用性而导致。然而，报道了可能导致其抗血栓作用的膜联蛋白A5的其他令人感兴趣的特性，特别是表面表达的组织因子的下调，或者与和止血有关联的另外配体(如硫脑苷脂和肝素)的相互作用以及尿激酶型纤溶酶原激活物的上调。膜联蛋白A5在体内作为内源性抗血栓系统一员的的生物学意义已被建议用于大脉管系统和胚胎微循环。
[0005]实际上，已知膜联蛋白A5在医学中、在提供直接治疗效果中具有大范围的应用。例子包括膜联蛋白A5的下列应用：
[0006]用于预防动脉粥样硬化性血栓形成和/或斑块破裂，如在WO 2005/099744中所描述(所述专利的内容通过引用并入本文)；
[0007]用于治疗血管功能障碍、减轻缺血性疼痛和/或治疗血管病破裂，如在WO 2009/077764中所描述(所述专利的内容通过引用并入本文)；
[0008]用于预防或治疗再狭窄，如在WO 2009/103977中所描述(所述专利的内容通过引用并入本文)；
[0009]用于抑制氧化心磷脂(oxCL)的活性并用于治疗、预防和/或减少患上心血管疾病、自身免疫性疾病或炎症状态的风险，如在WO 2010/069605中所描述(所述专利的内容通过引用并入本文)；以及
[0010]用于预防和/或减少在手术干预之后的围手术期或手术后并发症，例如血管手术(特别是外周血管手术)之后的并发症，如在WO 2012/136819中所描述(所述专利的内容通
过引用并入本文)。
[0011]因此，膜联蛋白A5代表具有高治疗利益和潜能的蛋白质。因此，迫切需要利用高效且具有成本效益的方法来生产治疗级膜联蛋白A5蛋白质的有效方法；所述方法可以被扩大并且方便地应用于工业规模生产(例如，从具有约1000L或以上培养体积的重组宿主细胞培养物中采集膜联蛋白A5蛋白质)。
[0012]一个具体的问题是，当在标准细菌宿主细胞，如大肠杆菌(E.coli)中重组地表达膜联蛋白A5时被来源于宿主细胞的成分(尤其是内毒素)所污染。内毒素是一种脂多糖(LPS)，所述脂多糖是由脂质和通过共价键连接的O抗原、外核以及内核所组成的多糖构成；LPS被发现于革兰氏阴性细菌的外膜中，并且在动物中引起强免疫应答。膜联蛋白A5的特征是其与含有带负电荷磷脂的生物膜的强结合，因此对内毒素有特别高的亲和力。这使得由内毒素产生宿主大规模地工业化生产膜联蛋白A5更加具有挑战性。
[0013]迄今为止，尚未提供这种方法以利用高效且具有成本效益的方法来生产治疗级膜联蛋白A5蛋白质，所述方法可以被扩大并且方便地应用于工业规模生产(例如，从具有约1000L或以上培养体积的重组宿主细胞培养物中采集膜联蛋白A5蛋白质)，更不用说以解决内毒素污染的方式。
[0014]1991年，Kumar报道了对用于膜联蛋白A5的生产和提纯的方法的开发(本科荣誉学院论文，标题为“人重组膜联蛋白V蛋白质的表达、提纯以及大规模生产”，呈递给阿肯色大学工学院化工学院，阿肯色州费耶特维尔市，可通过网址https：//uarkive.uark.edu/xmlui/handle/10826/981在线获得)。Kumar的方法包括：在100mL培养瓶中利用重组大肠杆菌宿主细胞来表达膜联蛋白A5，使细胞形成团块，在由50mM Tris HCl、10mM CaCl2(pH 7.2)所组成的匀化/裂解缓冲液的存在下重悬细胞，然后利用超声处理使细胞破裂从而释放出膜联蛋白A5蛋白质。所加入的CaCl2导致膜联蛋白A5以钙依赖性方式结合到碎片中的细胞膜，然后使混合物经历20分钟的第一提纯离心步骤，其后将上清液丢弃并且将含有细胞碎片和结合的膜联蛋白A5的细胞团块加以回收。使用EDTA将膜联蛋白A5从团块中释放出，接着是20分钟的第二提纯离心步骤和采集上清液中的膜联蛋白A5。然后，在DEAE
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琼脂糖凝胶柱上的阴离子交换和利用盐梯度对膜联蛋白A5进行洗脱的进一步的步骤之前，进行一夜透析从而将用于膜联蛋白A5的缓冲液改变为Tris HCl(pH 8.0)。
[0015]本专利技术申请人已意识到Kumar的方法中存在着许多限制和缺点。第一，其仅使用100mL培养物小规模进行，并且在提纯方法期间需要两个独立的离心步骤。这不可扩展到以高效方式使用大体积培养物(例如1000L或以上)的工业化方法。如下面进一步的描述，这种大体积流体的离心将会是非常耗时且昂贵的。然而，Kumar的方法必须采用离心，而离心依赖于作为初步捕获步骤的利用膜联蛋白A5与细胞碎片中膜的钙诱导结合。第二，本专利技术申请人已意识到Kumar的方法导致膜联蛋白A5蛋白质的高损失，例如由于对第一提纯离心步骤的产物上清液中未结合的可溶性膜联蛋白A5的处理。第三，Kumar的方法完全不能将内毒素去除到适合于治疗应用的水平，并且值得注意的是，没有对最后产物中的内毒素水平进行检查。因此，Kumar的方法不能以高效且有时效的方式扩展到工业生产，导致膜联蛋白A5蛋白质的高损失(即，低产率)并且导致不适合于治疗应用的低级蛋白质提纯。
[0016]2008年，位于华盛顿大学医学中心的实验室医学部的Tait研究实验室发表了标题为“由质粒pET12a
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PAPI生产重组膜联蛋白V”的文件。其可通过网址https：//
depts.washington.edu/labweb/Faculty/Tait/108.pdf在线获得。所描述的方法非常类似于由Kumar提出的方法。所述方法包括：在1L培养物中的重组大肠杆菌宿主细胞中表达膜本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从具有细胞壁的内毒素产生宿主细胞中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达细胞内蛋白质的方法，其中所述方法包括从所述宿主细胞中释放所述细胞内蛋白质，其特征在于，释放所述细胞内AnxA5蛋白的步骤在包含非离子洗涤剂的匀化缓冲液的存在下执行，并且优选地，其中所述方法不包括从所述宿主细胞中释放所述AnxA5蛋白之后回收和/或提纯所述AnxA5蛋白的任何离心步骤，并且/或者其中所述AnxA5蛋白除暂时地与任何色谱树脂结合外，在整个方法中保留在溶液中；任选地其中所述非离子洗涤剂是聚山梨醇酯，优选选自吐温20和吐温80的聚山梨醇酯，最优选吐温80。2.根据权利要求1所述的方法，其中释放所述细胞内AnxA5蛋白的步骤：
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在匀化缓冲液的存在下执行，所述匀化缓冲液包含有效地减少或防止膜联蛋白A5与内毒素之间结合的量的非离子洗涤剂；并且/或者
·
在匀化缓冲液的存在下执行，所述匀化缓冲液包含0.01至10％(w/w)非离子洗涤剂，如0.02至5％(w/w)、0.05至2％(w/w)或约1％(w/w)非离子洗涤剂。3.根据前述权利要求中任一项所述的从具有细胞壁的宿主细胞中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达细胞内蛋白质的方法，其中所述方法包括从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白，其中在从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白时或者在从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白之后，但在任何进一步的色谱提纯进行之前，所述匀化缓冲液中的游离钙离子浓度低于10mM，优选低于5mM、1mM，更优选低于500μM，或者基本上为零，并且/或者其中所述匀化缓冲液包含钙金属离子螯合剂，或者在释放所述细胞内AnxA5蛋白之后被改性而包含钙金属离子螯合剂；任选地其中所述钙金属离子螯合剂选自EDTA或其盐、EGTA或其盐，且最优选EDTA。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述游离钙离子的水平和/或钙金属离子螯合剂的量有效地降低或防止膜联蛋白A5与所述宿主细胞的细胞壁成分之间的结合。5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述匀化缓冲液包含或者被调节(在释放所述AnxA5蛋白之前或之后)而包含0.01至500mM，例如0.05至100mM、0.5至20mM、1至15mM、2至10mM或约4mM钙金属离子螯合剂，并且优选地，其中所述钙金属离子螯合剂是EDTA。6.根据权利要求3、4或5所述的方法，其中根据权利要求2、3或4中任一项所述的方法，所述匀化缓冲液包含非离子洗涤剂。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包含从所述宿主细胞的培养物中回收和/或提纯重组表达的细胞内AnxA5蛋白，并且其中所述培养物具有至少100L、500L、1,000L、5,000L或10,000L的体积。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括按每mL匀化缓冲液约10g生物质的浓度将来自所述宿主细胞培养物的生物质混合于所述匀化缓冲液中的步骤。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述匀化缓冲液中从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白的步骤包括对所述宿主细胞进行溶解、破裂、匀化、超声处理或压力处理，使得所述宿主细胞的细胞壁和细胞膜屏障破裂，并由此释放出细胞内AnxA5蛋
白，并且任选地，其中此步骤不包括渗透压冲击和/或冻结
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解冻步骤的采用；优选地其中从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白的所述步骤包括高压匀化，如在约400巴和约2,500巴之间的一个或多个循环的高压匀化，优选约600巴的三次匀化循环或约800巴的两次匀化循环。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中释放所述细胞内AnxA5蛋白的所述步骤形成包含所述释放的AnxA5蛋白的生物质匀浆；优选地，其中所述生物质匀浆还包含选自由以下组成的群组的杂质中的一种或多种(通常是全部)：宿主细胞蛋白、宿主细胞壁成分、宿主细胞膜、宿主细胞核酸以及内毒素。11.根据权利要求10所述的方法，其还包括以下步骤：澄清所述生物质匀浆，并由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的澄清化产物；优选地，其中澄清所述生物质匀浆的步骤包括利用核酸酶，如核酸酶A，优选来自粘质沙雷菌(Serratia marescens)的核酸酶A对所述匀浆进行处理，并且任选地，其中在释放所述细胞内AnxA5蛋白之前将所述核酸酶包含在所述匀化缓冲液中，并且/或者其中澄清所述生物质匀浆的步骤包括(优选在核酸酶处理之后)使包含所述释放的AnxA5蛋白的所述生物质匀浆通过过滤器(如纤维素或聚丙烯过滤器，优选地，其中所述过滤器是深度过滤器，并且/或者优选地，其中所述过滤器具有小于4μM的截止值)的步骤，并且其中所述过滤器流出物是包含所述释放的AnxA5蛋白的所述澄清化产物。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：使所述释放的AnxA5蛋白经过阴离子交换树脂以便执行第一阴离子交换步骤，并由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物；优选地，其中使根据权利要求11所述的方法所产生的包含所述释放的AnxA5蛋白的所述澄清化产物经历所述第一阴离子交换步骤，由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物。13.根据权利要求12所述的方法，其中在所述第一阴离子交换步骤之前，对所述释放的AnxA5蛋白的环境的一个或多个参数进行调节，所述参数选自由以下组成的群组：pH、电导率、钙离子螯合剂的水平以及非离子洗涤剂的水平。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中在约6.9的pH值、约2.8mS/cm的电导率、约1mM的钙离子螯合剂浓度下，对经历所述阴离子交换步骤的所述释放的AnxA5蛋白进行配制，并且利用非离子洗涤剂稀释，例如以获得0.01至1％(w/v)，更优选约0.1％(w/v)的最终非离子洗涤剂浓度。15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述AnxA5蛋白在所述阴离子交换步骤期间结合，并且为了释放所述结合的AnxA5蛋白，将清洗溶液和/或洗脱缓冲液施加到所述阴离子交换树脂中，产生了包含所述释放的AnxA5蛋白的所述第一阴离子交换产物，任选地，其中所述洗脱缓冲液包含NaCl，例如约300mM的NaCl。16.一种用于从包含膜联蛋白A5(AnxA5)和一种或多种杂质的溶液中回收和/或提纯包含所述AnxA5蛋白序列的蛋白质的方法，所述方法包括：使包含所述AnxA5蛋白和一种或多种杂质的所述溶液经过阴离子交换树脂，以便执行第一阴离子交换步骤，并由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物；和使所述第一阴离子交换产物直接地或间接地经历亲和色谱步骤，由此产生包含所述释
放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物；并且优选地，其中所述AnxA5蛋白在整个所述方法中，包括任何之前或之后的步骤，除暂时地与任何色谱树脂结合时外，均保留在溶液中。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述亲和色谱步骤包括使所述AnxA5蛋白与固定化肝素结合，并且其中利用钙离子的存在促进所述结合；优选地其中利用含有钙离子螯合剂，如EDTA的洗脱缓冲液将所述AnxA5蛋白从所述固定化肝素中洗脱出。18.一种用于从包含膜联蛋白A5(AnxA5)蛋白和一种或多种杂质的溶液中回收和/或提纯包括所述AnxA5蛋白序列的蛋白质的方法，所述方法包括：在吐温80存在下(优选地在0.1％吐温80存在下)使包含所述AnxA5蛋白和一种或多种杂质的所述溶液经历肝素亲和色谱步骤，由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物；并且优选地，其中所述AnxA5蛋白在整个所述方法中，包括任何之前或之后的步骤，除暂时地与任何色谱树脂结合外，均保留在溶液中。19.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：使所述释放的AnxA5蛋白经历亲和色谱步骤，由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物；优选地，其中使根据权利要求12至15中任一项所述的方法所产生的所述第一阴离子交换产物中的AnxA5蛋白经历所述亲和色谱步骤。20.根据权利要求19所述的方法，其包括以下步骤，其中：(a)利用根据权利要求11所述的方法澄清根据权利要求10的包含所述释放的AnxA5蛋白的生物质匀浆，并由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的澄清化产物，以及(b)根据权利要求12至15中的任一项，使所述澄清化产物中的所述AnxA5蛋白经过阴离子交换树脂，以便执行第一阴离子交换步骤，并由此产生包含所述AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物，以及(c)其中根据权利要求19，使所述第一阴离子交换产物中的所述AnxA5蛋白经历亲和色谱步骤。21.根据权利要求19或20所述的的方法，其中所述亲和色谱步骤包括使所述AnxA5蛋白与固定化肝素结合，并且任选地，其中利用钙离子的存在促进所述结合；优选地其中利用含有钙离子螯合剂，如EDTA的洗脱缓冲液将所述AnxA5蛋白从所述固定化肝素中洗脱出。22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述第一亲和色谱产物包含所述释放的AnxA5蛋白和钙离子螯合剂，如EDTA或EGTA，其任选地在0.1至500mM的范围内，更优选约10mM。23.一种用于从包含膜联蛋白A5(AnxA5)和钙金属离子螯合剂的组合物中回收和/或提纯包含所述AnxA5蛋白序列的蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括使所述组合物经历阴离子交换树脂，以便执行阴离子交换步骤，并由此从所述组合物中回收和/或提纯所述AnxA5蛋白；并且其特征还在于，所述阴离子交换步骤是在另外选择的金属离子存在下执行，其中对所述另外选择的金属离子进行选择，以使得所述钙金属离子螯合剂对所述所选
择金属离子的结合亲和力大于其对所述阴离子交换树脂的结合亲和力，但小于其对钙离子的结合亲和力；并且优选地，其中所述AnxA5蛋白在整个所述方法中，包括任何之前的或之后的步骤，除暂时地与任何色谱树脂结合外，均保留在溶液中；优选地其中所述钙金属离子螯合剂选自EDTA或其盐、EGTA或其盐，且最优选EDTA。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂过量存在于所述组合物中，且/或以约或至少0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM或更大的浓度存在于所述组合物中。25.根据权利要求23或24所述的方法，其中：
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所述所选择金属离子是二价阳离子，例如Mg
2+
离子；
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在所述阴离子交换步骤期间，所述所选择金属离子的存在量在所述组合物经历所述阴离子交换树脂的过程期间有效地减少或防止所述钙离子螯合剂与所述阴离子交换树脂之间的相互作用；
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在所述阴离子交换步骤期间，在所述钙离子螯合剂存在下，所述所选择金属离子的存在量有效地增加所述AnxA5蛋白与所述阴离子交换树脂的结合，并相较于在所述阴离子交换步骤期间当没有所选择金属离子存在时所观测的损失水平，由此减少AnxA5蛋白在流经所述阴离子交换步骤时的损失；并且/或者
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所述所选择金属离子在所述阴离子交换步骤(例如，添加到包含所述AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂的组合物中，随后使所述组合物经历所述阴离子交换树脂)期间存在的浓度是约1至约100mM，如约2至约50mM、约5至约25mM、约10至约15mM或约12.5mM。26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂是EDTA并且所选择金属离子是Mg
2+
离子，并且优选地，Mg
2+
离子与EDTA的摩尔比是在0.5∶1至2∶1的范围内，最优选至少1∶1或更大。27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中包含所述AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂并经历所述阴离子交换树脂的所述组合物是前一程序的直接或间接产物，所述前一程序包括以下步骤：使所述AnxA5蛋白经历亲和色谱步骤并且用钙离子螯合剂对所述AnxA5蛋白进行洗脱，由此产生亲和色谱产物，所述亲和色谱产物是包含所述AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂的组合物；优选地其中所述前一亲和色谱步骤包括使所述AnxA5蛋白与固定化肝素结合，并且任选地，其中利用钙离子的存在促进所述结合；更优选地其中利用含有钙离子螯合剂，如EDTA或EGTA的洗脱缓冲液将所述AnxA5蛋白从所述固定化肝素中洗脱出。28.根据权利要求27所述的方法，其中在所述前一亲和色谱步骤与所述阴离子交换步骤之间不存在透析步骤，并且/或者在所述直接或间接产物施加于所述阴离子交换步骤之前，不将钙离子螯合剂从前一亲和色谱步骤的产物中去除。29.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其中在所述阴离子交换步骤之前或期间，将所述所选择金属离子加入到所述组合物中。30.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述方法包括根据权利要求23至29中任一项的阴离子交换步骤。
31.一种用于从具有细胞壁的宿主细胞或由权利要求7所定义的其培养物中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达细胞内蛋白质的方法，其中：(a)所述方法包括根据权利要求1或2在包含非离子洗涤剂的匀化缓冲液存在下，从所述宿主细胞中释放所述细胞内蛋白质；(b)任选地，其中所述释放步骤是根据权利要求中8至10中的任一项进行；(c)另外任选地，其中所述方法包括根据权利要求11澄清所述生物质匀浆的步骤；(d)其中所述方法还包括根据权利要求12至15中任一项的以下步骤：任选地在钙离子螯合剂的存在下，使所述释放的AnxA5蛋白直接地或间接地经历阴离子交换树脂，以便执行第一阴离子交换步骤，并由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物；(e)其中所述方法还包括根据权利要求16至22中任一项的以下步骤：使所述释放的AnxA5蛋白直接地或间接地经历亲和色谱步骤，以及(f)其中所述亲和色谱步骤的产物是包含所述AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂的组合物；以及(g)其中使所述亲和色谱步骤的包含所述AnxA5蛋白和所述钙金属离子螯合剂的所述直接或间接产物根据权利要求23至30中的任一项经历阴离子交换步骤；并且优选地，其中步骤(a)至(g)均不包括或均不在其间插入选自离心和/或透析的一个或多个步骤，并且更优选地，其中所述AnxA5蛋白除了暂时地与阴离子交换和亲和色谱固相结合外，在整个所述方法中均保持可溶。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括优选地在根据前述权利要求中任一项所述的方法结束时执行一个或多个选自由以下组成的群组的其他步骤：浓缩、缓冲液更换、调节和过滤(如无菌过滤)，以及任选地将所述含有AnxA5蛋白的产物储存于无菌容器中的最后步骤；优选地其中所述其他步骤中的一个是渗滤，任选地，其中所述渗滤步骤的产物含有浓度为至少约1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、50mg/mL、100mg/mL或更高的所述AnxA5蛋白。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述过滤使用0.45
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0.2μm过滤器或0.22μm过滤器，并且优选无菌过滤步骤。34.根据权利要求32...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯，
申请(专利权)人：安尼欣制药有限公司，
类型：发明
国别省市：