一种脾氨肽内多肽的提取方法技术

本发明专利技术公开了脾氨肽内多肽的提取方法，包括以下步骤，步骤一，试剂配制，配制流动相A、流动相B；步骤二，样品处理，将脾氨肽加入到起始流动相中，得到样品溶液；步骤三，分离纯化。本发明专利技术具有以下优点和效果：采用色谱分离技术，色谱柱吸附脾氨肽内的多肽、糖、游离氨基酸、核苷酸等物质，梯度洗脱过程中，将多肽从色谱柱上集中洗脱出来；在色谱分离过程中，选用合适的流动相以及色谱柱，能将脾氨肽内的多肽集中洗脱，多个色谱峰之间间隔较大，达到了分离纯化脾氨肽内多肽、分离效果好、操作简单的效果。

A method for the extraction of peptidyl peptide from spleen Aminopeptide

The invention discloses a method for extracting peptidyl peptide of spleen Aminopeptide, including the following steps: step one, preparation of reagents, preparing mobile phase A, mobile phase B, step two, sample treatment, adding spleen Aminopeptide into the starting flow phase, obtaining sample solution; step three, separation and purification. The invention has the following advantages and effects: the chromatographic column is used to adsorb peptides, sugar, free amino acids and nucleotides in splenopeptide, and the peptide is eluted from the column in the process of gradient elution. In the process of chromatographic separation, a suitable mobile phase and a chromatographic column can be selected and the spleen can be used. The peptide concentration in Aminopeptide was concentrated, and the intervals between the peaks were large, and the separation and purification of peptidyl peptide in the peptide was achieved, and the effect of separation was good and the operation was simple.

【技术实现步骤摘要】
一种脾氨肽内多肽的提取方法
本专利技术涉及生物制品领域，特别涉及一种脾氨肽内多肽的提取方法。
技术介绍
脾氨肽口服冻干粉属于从脏器提取的生化药，主要成分包括氨基酸、多肽、核苷酸等物质，作为免疫体调节剂，用于反复呼吸道感染、支气管炎、哮喘、肺炎、癌症等病症的辅助治疗。临床观察显示，能够有效提高患者的抵抗力，减少呼吸道感染的发生率，并具有调节细胞免疫的功能，脾氨肽中主要的活性物质为多肽，国家药品标准WS1-(X-002)-2002Z中，测定多肽的含量是控制脾氨肽产品含量的唯一指标，将脾氨肽内的多肽分离纯化后，对于研究脾氨肽作为免疫调节剂的作用机制，以及将分离的多肽作为冻干粉制剂以显著提高药品的活力，都具有显著的作用和意义，因此，有必要提出一种脾氨肽内多肽的提取方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种脾氨肽内多肽的提取方法，具有分离脾氨肽内多肽的效果。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种脾氨肽内多肽的提取方法，包括以下步骤步骤一，试剂配制，配制流动相A、流动相B，流动相A内溶剂为水、溶质为质量百分比浓度为0.1％的甲酸，流动相B内溶剂为乙腈、溶质包括质量百分比浓度为0.1％的甲酸和质量百分比浓度为0.1％的环己醚；步骤二，样品处理，将脾氨肽加入到起始流动相中，得到样品溶液；步骤三，分离纯化，色谱条件：色谱柱内填料颗粒为多孔硅胶，填料颗粒直径为5μm，色谱柱内径为2.1mm，柱长为75mm，柱温40℃，梯度洗脱0min-13min-13.5min-26min-35min,流动相B5％-11.2％-15.8％-36％-60％；流速0.5ml/min，进样体积为20μL，检测波长214nm，收集出峰时间为16.060-16.462min、23.072-24.022min、29.968-31.451min的色谱峰，得到分离出来的多肽。通过采用上述技术方案，色谱分离是一种分离复杂混合物中各种组分的有效方法，利用不同物质在固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当流动相和固定相相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复的分配，从而使各组分达到分离。脾氨肽内主要组分包括多肽、游离氨基酸、核苷酸、糖，本申请采用色谱分离技术从脾氨肽内分离纯化出多肽，色谱分离的条件中，选用硅胶柱作为色谱柱，流动相A内溶剂为水，溶质为甲酸，流动相B内溶剂为乙腈，溶质为甲酸和环己醚，采用梯度洗脱的方法，0-13min时，流动相组分内包括95％的流动相A和5％的流动相B，将脾氨肽内的游离氨基酸、核苷酸从色谱柱上洗脱下来；13-13.5min，流动相组分内包括88.8％的流动相A和11.2％的流动相B，将脾氨肽内的核苷酸和糖从色谱柱上洗脱下来。通过梯度洗脱的方式，陆续从各组分分离出来，由于脾氨肽内成分复杂，色谱分离技术在分离纯化脾氨肽内的多肽时，很难将多肽与脾氨肽内的其他组分如糖、核苷酸等物质彻底分离。因此，本申请在流动相中加入环已醚，环已醚加入流动相B中，在梯度洗脱过程中能明显改善出峰趋势，在步骤三的色谱条件下，使脾氨肽内的多肽集中在出峰时间为16.060-16.462min、23.072-24.022min、29.968-31.451min的色谱峰，能够将脾氨肽内的多肽从脾氨肽内分离出来，达到了分离纯化脾氨肽内多肽的效果。本专利技术的进一步设置为：还包括步骤四，冷冻干燥，对步骤三得到的样品冷冻干燥处理，得到冻干粉。通过采用上述技术方案，冷冻干燥即真空冷冻干燥，简称冻干，是将湿物料或溶液在较低的温度下冻结成固态，然后在真空下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱水的干燥技术，通过将步骤三得到的样品冷冻干燥，以冻干粉的形式进行保存。本专利技术的进一步设置为：步骤二，样品处理，用透析袋对脾氨肽原液进行透析，将透析后的脾氨肽原液内加入起始流动相，用0.22μm有机膜过滤，得到样品溶液。通过采用上述技术方案，样品处理中，先对脾氨肽原液进行透析，透析处理后加入起始流动相，在步骤三的色谱条件中，起始流动相的组分为95％的流动相A和5％的流动相B，先通过透析去除脾氨肽原液内的小分子物质，再过来去除大分子蛋白质之类的杂质。本专利技术的进一步设置为：步骤二，样品处理中，每500μL脾氨肽原液内加入200μL起始流动相。通过采用上述技术方案，每500μL脾氨肽原液内加入200μL起始流动相。本专利技术的进一步设置为：步骤二，样品处理，取脾氨肽原液离心，离心条件为：12000rpm、10min、4℃，离心后取上清液，加入到起始流动相内，用0.22μm有机膜滤过，得到样品溶液。通过采用上述技术方案，样品处理时，取脾氨肽原液离心，在4℃下离心10分钟，再通过孔径为0.22μm的有机膜滤过，去除脾氨肽原液内的大分子杂质，减少色谱分离时大分子物质的干扰，提高色谱分离提取多肽的准确性。本专利技术的进一步设置为：步骤二中，每600μL上清液加入100μL起始流动相。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：采用色谱分离技术，色谱柱吸附脾氨肽内的多肽、糖、游离氨基酸、核苷酸等物质，梯度洗脱过程中，将多肽从色谱柱上集中洗脱出来，达到了分离纯化脾氨肽内多肽、分离效果好的效果。具体实施方式实施例1：一种脾氨肽内多肽的提取方法，包括以下步骤，步骤一，试剂配制，配制流动相A、流动相B，流动相A内溶剂为水、溶质为质量百分比浓度为0.1％的甲酸，流动相B内溶剂为乙腈、溶质包括质量百分比浓度为0.1％的甲酸和质量百分比浓度为0.1％的环己醚。步骤二，样品处理，用透析袋对脾氨肽原液进行透析，将透析后的脾氨肽原液内加入起始流动相，每500μL脾氨肽原液内加入200μL起始流动相，用0.22μm有机膜过滤，得到样品溶液。步骤三，分离纯化，色谱条件：色谱柱为硅胶柱，填料颗粒为多孔硅胶，填料颗粒直径为5μm，色谱柱内径为2.1mm，柱长为75mm，色谱柱选用AgilentPoroshell300SB-C18。柱温40℃，梯度洗脱0min-13min-13.5min-26min-35min,流动相B5％-11.2％-15.8％-36％-60％，如表1所示；流速为0.5ml/min，进样体积为20μL，检测波长214nm，分段收集样品，样品收集的时间段见表2。鉴定试验：测定各时间段内样品内的总糖含量、核苷酸含量、多肽含量，其中多肽含量采用BCA试剂盒进行检测，将检测结果在表2中列出。收集出峰时间为16.060-16.462min、23.072-24.022min、29.968-31.451min的色谱峰，得到分离出来的多肽。步骤四，冷冻干燥，对步骤三得到的样品冷冻干燥处理，得到冻干粉。表1时间(min)流动相A(％)流动相B(％)09551395513.59552695535955表2样品名时间段/min核苷酸(μg/ml)糖(μg/ml)多肽(μg/ml)Fraction10-16.060＞202.5-50.025-0.05Fraction216.060-16.4628-122.5-50.4-0.5Fraction316.462-23.0728-122.5-50.1-0.2Fraction423.072-24.022无2.5-50.4-0.5Fraction524.022-29.9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脾氨肽内多肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤步骤一，试剂配制，配制流动相A、流动相B，流动相A内溶剂为水、溶质为质量百分比浓度为0.1％的甲酸，流动相B内溶剂为乙腈、溶质包括质量百分比浓度为0.1％的甲酸和质量百分比浓度为0.1％的环己醚；步骤二，样品处理，将脾氨肽加入到起始流动相中，得到样品溶液；步骤三，分离纯化，色谱条件：色谱柱内填料颗粒为多孔硅胶，填料颗粒直径为5μm，色谱柱内径为2.1mm，柱长为75mm，柱温40℃，梯度洗脱0min‑13min‑13.5min‑26min‑35min,流动相B 5％‑11.2％‑15.8％‑36％‑60％；流速0.5ml/min，进样体积为20μL，检测波长214nm，收集出峰时间为16.060‑16.462min、23.072‑24.022min、29.968‑31.451min的色谱峰，得到分离出来的多肽。

【技术特征摘要】
1.一种脾氨肽内多肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤步骤一，试剂配制，配制流动相A、流动相B，流动相A内溶剂为水、溶质为质量百分比浓度为0.1％的甲酸，流动相B内溶剂为乙腈、溶质包括质量百分比浓度为0.1％的甲酸和质量百分比浓度为0.1％的环己醚；步骤二，样品处理，将脾氨肽加入到起始流动相中，得到样品溶液；步骤三，分离纯化，色谱条件：色谱柱内填料颗粒为多孔硅胶，填料颗粒直径为5μm，色谱柱内径为2.1mm，柱长为75mm，柱温40℃，梯度洗脱0min-13min-13.5min-26min-35min,流动相B5％-11.2％-15.8％-36％-60％；流速0.5ml/min，进样体积为20μL，检测波长214nm，收集出峰时间为16.060-16.462min、23.072-24.022min、29.968-31.451min的色谱峰，得到分离出来的多肽。2.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：李起竖，李一钊，卢进军，卢丽琴，金洁，
申请(专利权)人：浙江丰安生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33