具有递送功能和基因表达调控能力的单链核酸分子制造技术

本发明专利技术提供一种单链核酸，其具有递送功能，能够抑制靶基因的表达。本发明专利技术的单链核酸分子含有区域(Xc)、连接子区域(Lx)和区域(X)，其中前述区域(Xc)与前述区域(X)互补，前述区域(X)和前述区域(Xc)的至少之一包含抑制靶基因表达的表达抑制序列，并且具有递送功能的生物相关物质结合至选自由该单链核酸分子的5’末端、3’末端、和前述连接子区域(Lx)组成的组的至少之一。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有递送功能和基因表达调控能力的单链核酸分子
本专利技术涉及具有递送功能(deliveryfunction)和基因表达调控能力的单链核酸分子、包含其的组合物及其用途。
技术介绍
作为用于抑制基因表达的技术，例如RNA干扰(RNAi)是已知的(非专利文献1)。RNA干扰对基因表达的抑制一般例如通过将短双链RNA分子投与至细胞等来进行。前述双链RNA分子一般称作siRNA(小干扰RNA)。已报道称基因表达还可被经分子内退火而具有部分形成于其中的双链的环状RNA分子所抑制(专利文献1)。然而，在这些技术中，诱导基因表达抑制的RNA分子具有下列问题。首先，为了生产前述siRNA，必须单独合成正义链和反义链并在该过程结束时将这些链杂交。因此，存在制造效率低下的问题。此外，当前述siRNA投与至细胞时，必须在抑制单链RNA解离的同时将siRNA投与至细胞，这需要设定用于操作siRNA的条件的繁重工作。环状RNA分子具有的问题在于其合成困难。为了应对现状，本专利技术人构建了新的单链核酸分子，解决了上述问题(专利文献2、3)。[现有技术文献][专利文献]专利文献1:特开2008-278784专利文献2:国际公报WO2012/017919号专利文献3:国际公报WO2013/180038号[非专利文献]非专利文献1:Fire,等人,Nature,第391卷,p.806-811,1998
技术实现思路
专利技术要解决的问题此外，此类新的单链核酸分子需要进一步实现至靶组织或细胞的优异递送功能。因此，本专利技术旨在提供具有递送功能的能够抑制靶基因表达的单链核酸。用于解决问题的方案为了实现前述目的，本专利技术的单链核酸分子为靶基因表达抑制用单链核酸分子，所述单链核酸分子包括区域(X)、连接子区域(Lx)、和区域(Xc)，其中前述区域(X)与前述区域(Xc)互补，前述区域(X)和前述区域(Xc)的至少之一包括抑制靶基因表达的表达抑制序列，并且具有递送功能的生物相关物质(bio-relatedsubstance)结合至选自由该靶基因表达抑制靶基因表达抑制用单链核酸分子的5’末端、3’末端、和前述连接子区域(Lx)组成的组的至少之一。专利技术的效果本专利技术的单链核酸分子能够实现向靶组织或细胞的优异递送功能，而不必须(essentially)需要例如递送用载体。因此，例如，不需要考虑载体的毒性，并且可避免设定与形成核酸分子和载体的复合体相关的各种条件的研究。因此，例如，可减少生产和使用方面的劳力和成本。附图说明图1示出说明本专利技术的单链核酸分子的实例的示意图图2为在本专利技术的实施例中纯化后的C18缀合(conjugated)的单链核酸分子的HPLC图。图3为在本专利技术的实施例中纯化后的DOPE缀合的单链核酸分子的HPLC图。图4为在本专利技术的实施例中纯化后的乳糖缀合的单链核酸分子的HPLC图。图5为在本专利技术的实施例中纯化后的GE11缀合的单链核酸分子的HPLC图。图6为在本专利技术的实施例中纯化后的GE11(7)缀合的单链核酸分子的HPLC图。图7为在本专利技术的实施例中纯化后的GE11(5)缀合的单链核酸分子的HPLC图。图8为在本专利技术的实施例中纯化后的GE11缀合的单链核酸分子的HPLC图。图9为在本专利技术的实施例中纯化后的GE11(7)缀合的单链核酸分子的HPLC图。图10为在本专利技术的实施例中纯化后的GE11(5)缀合的单链核酸分子的HPLC图。图11为示出本专利技术的实施例中TGF-β1的表达量的相对值的图。图12为示出本专利技术的实施例中TGF-β1的表达量的相对值的图。图13为示出本专利技术的实施例中TGF-β1的表达量的相对值的图。图14为示出本专利技术的实施例中TGF-β1的表达量的相对值的图。图15示出本专利技术的实施例中显示与Dicer蛋白质的反应性的电泳的结果。图16示出本专利技术的实施例中显示与Dicer蛋白质的反应性的电泳的结果。图17示出本专利技术的实施例中显示稳定性的电泳的结果。具体实施方式除非另有说明，本说明书中使用的术语意指它们在本领域中通常的含义。1.ssNc分子如前所述，本专利技术的单链核酸分子为靶基因表达抑制用单链核酸分子，其包括区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)，其特征在于前述区域(X)与前述区域(Xc)互补，前述区域(X)和前述区域(Xc)的至少之一含有抑制靶基因表达的表达抑制序列，和具有递送功能的生物相关物质结合至选自由该靶基因表达抑制用单链核酸分子的5’末端、3’末端、和前述连接子区域(Lx)组成的组的至少之一。本专利技术中，“靶基因的表达抑制”意指例如抑制前述靶基因的表达。前述抑制实现的机理不特别限定，并可为例如下调或沉默。前述靶基因的表达抑制可通过例如来源于靶基因的转录产物量的降低；前述转录产物活性的降低；由前述靶基因产生的翻译产物量的降低；或前述翻译产物活性的降低等来证实。前述翻译产物可为例如成熟蛋白质、进行加工之前或翻译后修饰的前体蛋白质。本专利技术的单链核酸分子在下文中还可称为本专利技术的“ssNc分子”。本专利技术的ssNc分子可用于体内或体外抑制例如靶基因的表达，且还可称为“靶基因的表达抑制用ssNc分子”或“靶基因的表达抑制剂”。此外，本专利技术的ssNc分子可通过例如RNA干扰来抑制前述靶基因的表达，且其还可称为“RNA干扰用ssNc分子”、“RNA干扰诱导分子”、“RNA干扰剂”或“RNA干扰诱导剂”。本专利技术的ssNc分子还可例如抑制干扰素诱导等的副作用。本专利技术的ssNc分子中，5’-末端和3’-末端不互相连接。因此本专利技术的ssNc分子还可称为线性单链核酸分子。本专利技术的ssNc分子中，前述区域(Xc)与前述区域(X)互补，前述区域(Xc)向前述区域(X)折回，前述区域(Xc)和前述区域(X)可通过自身退火形成双链。在本专利技术的ssNc分子中，前述表达抑制序列为显示例如将本专利技术的ssNc分子体内或体外引入细胞时抑制前述靶基因表达的活性的序列。前述表达抑制序列不特别限定，且可根据靶基因的种类适当设定。作为前述表达抑制序列，例如，由siRNA引起的RNA干扰中涉及的序列可适当使用。一般而言，RNA干扰为以下的现象：长双链RNA(dsRNA)在细胞中被Dicer裂解(cleaved)以产生由约19至21个碱基对组成且具有凸出的3’末端的双链RNA(siRNA：小干扰RNA)，并且单链RNA之一结合至靶mRNA以降解前述mRNA，从而抑制mRNA的翻译。作为结合至前述靶mRNA的前述siRNA的单链RNA的序列，例如，已报道了用于各种靶基因的各种序列。在本专利技术中，例如，前述siRNA的单链RNA的序列可用作前述表达抑制序列。在本专利技术中，不仅可使用在本申请提交时已知的siRNA的单链RNA的序列，而且还可使用未来将鉴定出的序列，例如作为前述表达抑制序列。前述表达抑制序列为例如优选与前述靶基因的设定区域至少90％的互补、更优选95％的互补，仍更优选98％的互补，且特别优选100％的互补。当满足这种互补时，例如可充分减少脱靶效应。推测前述由本专利技术ssNc分子造成的靶基因表达的抑制，例如通过由在前述区域(X)和前述区域(Xc)的至少之一中配置前述表达抑制序列的结构所引起的RNA干扰或类似于RNA干扰的现象(RNA干扰样的现象)来实现。然而，应注意的是，本专利技术决不限本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶基因表达抑制用单链核酸分子，其包括区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)，其中所述区域(X)与所述区域(Xc)互补，所述区域(X)和所述区域(Xc)的至少之一含有抑制靶基因表达的表达抑制序列，和具有递送功能的生物相关物质结合至选自由所述靶基因表达抑制用单链核酸分子的5’‑末端、3’‑末端、和所述连接子区域(Lx)组成的组的至少之一。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.27 JP 2015-0657701.一种靶基因表达抑制用单链核酸分子，其包括区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)，其中所述区域(X)与所述区域(Xc)互补，所述区域(X)和所述区域(Xc)的至少之一含有抑制靶基因表达的表达抑制序列，和具有递送功能的生物相关物质结合至选自由所述靶基因表达抑制用单链核酸分子的5’-末端、3’-末端、和所述连接子区域(Lx)组成的组的至少之一。2.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其中所述生物相关物质是选自由脂质、肽和碳水化合物组成的组的至少之一。3.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其中所述生物相关物质是脂质。4.根据权利要求3所述的单链核酸分子，其中所述脂质是单纯脂质、复合脂质、衍生脂质、单链脂质、双链脂质、糖脂质、脂溶性维生素或类固醇。5.根据权利要求3所述的单链核酸分子，其中所述脂质是选自由以下组成的组的至少之一：棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、DOPE和胆固醇。6.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其中所述生物相关物质是肽。7.根据权利要求6所述的单链核酸分子，其中所述肽是选自由以下组成的组的至少之一：从抗体衍生的肽、穿膜肽、作用于特定受体的肽、和与特定蛋白质相互作用的肽。8.根据权利要求6或7所述的单链核酸分子，其中所述肽具有由SEQIDNOs:1-28任意之一所示的氨基酸序列。9.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其中所述生物相关物质是碳水化合物。10.根据权利要求9所述的单链核酸分子，其中所述碳水化合物是选自由以下组成的组的至少之一：单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖和多糖。11.根据权利要求1至10任一项所述的单链核酸分子，其中所述连接子区域(Lx)含有下述式(I)：在所述式(I)中，X1和X2各自独立地为H2、O、S、或NH；Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O、或S；L1为具有n个碳原子的亚烷基链，亚烷基碳原子上的氢原子可用或可不用OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa取代，或，L1为通过用氧原子取代所述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，条件是：当Y1为NH、O、或S，L1中与Y1结合的原子是碳，L1中与OR1结合的原子是碳，氧原子互不相邻；L2为具有m个碳原子的亚烷基链，亚烷基碳原子上的氢原子可用或可不用OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH、或SRc取代，或L2为通过用氧原子取代所述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，条件是：当Y2为NH、O、或S，L2中与Y2结合的原子是碳，L2中与OR2结合的原子是碳，氧原子互不相邻；Ra、Rb、Rc、和Rd各自独立地为取代基或保护基团；m为0至30范围内的整数；n为0至30范围内的整数；所述区域(Xc)和(X)各自通过-OR1-或-OR2-与所述连接子区域(Lx)连接，其中R1和R2可存在或可不存在，当它们存在，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或所述结构(I)；和A为任意原子团，下述式(Ia)为所述氨基酸，下述式(Ia)为除肽以外的氨基酸：12.根据权利要求11所述的单链核酸分子，其中，在式(I)中，A含有选自由链式原子团、脂环式原子团、和芳族原子团组成的组的至少之一，其中各原子团任选地进一步具有取代基或保护基团。13.根据权利要求12所述的单链核酸分子，其中所述氨基酸是天然氨基酸或人工氨基酸。14.根据权利要求12所述的单链核酸分子，其中所述氨基酸是甘氨酸、α-丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、羟基赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、色氨酸、β-丙氨酸、1-氨基-2-...

【专利技术属性】
技术研发人员：青木绘里子，加藤志织，大木忠明，
申请(专利权)人：株式会社博纳克，
类型：发明
国别省市：日本,JP