一种small RNA的文库构建及测序方法技术

本申请公开了一种small RNA的文库构建及测序方法。本申请的建库方法包括：(1)将small RNA片段与CG文库3’接头连接；(2)将步骤(1)产物与CG文库5’接头连接；(3)将步骤(2)产物反转录成cDNA；(4)对cDNA进行PCR扩增，纯化回收PCR扩增产物；(5)对纯化回收PCR扩增产物进行单链分离，将单链DNA环化；(6)对环化产物进行酶切消化，回收，获得small RNA CG文库。本申请的建库方法，针对small RNA提供了新的CG文库建库方案，使得基于CG测序的全基因组水平small RNA测序得以实现，为新small RNA分子挖掘、癌症靶基因预测和鉴定、样品间差异表达分析、small RNA聚类和表达谱分析等奠定了基础，也为癌症早期诊断和靶向治疗检测提供了科学依据。

【技术实现步骤摘要】
一种smallRNA的文库构建及测序方法
本申请涉及smallRNA建库和测序领域，特别是涉及一种smallRNA的文库构建方法和测序方法。
技术介绍
近年流行病学资料显示，我国新发肺癌病例60万人，为当年恶性肿瘤新发病例的19.59％，居恶性肿瘤首位。即使在药物科学发达的现代，肺癌病人的5年生存率，尤其是除血癌患者以外的实体瘤患者的5年生存率小于50％。所有癌症患者中，大约2/3在晚期被诊断，大多数是在癌症诊断后两年内死亡。癌症治疗中的这种拙劣的结果不仅是治疗方法的问题，更重要的是，一方面，癌症的早期诊断非常困难，即便是癌症晚期要实现精确地确诊也不容易；另一方面，在采取治疗措施后的预后和对癌症患者的跟踪(即所谓的follow-up)，也很不容易。SmallRNA是一大类调控分子，几乎存在于所有的生物体中。SmallRNA包括：miRNA、ncRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、rasiRNA等等。SmallRNA通过多种多样的作用途径，包括mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成以及DNA去除等，来调控生物体的生长发育和疾病发生。SmallRNA在癌组织和非癌组织之间的表达存在很大的差异，且特定的smallRNA表达异常与特定的癌症相关，因而smallRNA可以用来作为诊断癌症的分子标记，如来源于外体(exosome)的miR-21可以作为几种癌症的预后指标，miR-21与miR-31和食道癌相关。此外，如果可以控制外体中miRNA的表达和释放或者利用外体携带发送一些具有治疗作用的miRNA等分子到靶细胞，则可以进行一些癌症和疾病的靶向治疗。通过构建smallRNA文库以及对smallRNA文库进行大规模的测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的smallRNA图谱，实现包括新smallRNA分子的挖掘，起作用靶基因的预测和鉴定，样品间差异表达分析，SmallRNA聚类和表达谱分析等科学应用。随着二代测序技术的发展，RocheGSFLXTitanium、IlluminaSolexaGAIIx和ABSOLID4均可以对smallRNA进行大规模测序分析，IlluminaSolexaGAIIx和ABISolid的读长正好配合了smallRNA的短序列且通量大，可以得到更高的覆盖率，IlluminaSolexaGAIIx在smallRNA测序中广泛应用。完整基因组(CompleteGenomics，缩写CG)测序是一种新的二代测序技术，它采用高密度DNA纳米芯片技术，在芯片上嵌入DNA纳米球，用非连续、非连锁联合探针锚定(cPAL)技术读取序列，具有更高的通量，且每个基因组测序的费用低至1000美元。总之，基于CG文库构建的CG测序技术具有建库成本低、操作简单、时间短、建库成功率高、测序快等特点，有很高的推广价值。目前，尚未有关于smallRNACG文库构建和smallRNACG测序的相关研究和报道；因此，研究一种适用于smallRNA的CG测序的建库方法，对于大规模的smallRNA测序，以及smallRNA的深入研究和开发具有重要意义。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种新的smallRNA的文库构建方法，用于smallRNACG文库建库的试剂盒，以及基于smallRNA文库构建的测序方法。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种smallRNA的文库构建方法，包括以下步骤；(1)将smallRNA片段与CG文库的3’接头连接；(2)将步骤(1)的产物与CG文库的5’接头连接；(3)将步骤(2)的产物反转录成cDNA；(4)对步骤(3)获得的cDNA进行PCR扩增，并纯化回收PCR扩增产物；(5)对纯化回收PCR扩增产物进行单链分离，并将获得的单链DNA环化；(6)对单链DNA环化的产物进行酶切消化，并回收酶切消化后的产物，即获得smallRNACG文库。需要说明的是，本申请的smallRNA的文库构建方法，相比于一般的DNACG文库的建库方法，有以下改进和不同：1)DNACG文库的构建需要对建库片段进行去磷酸化以及末端补平处理，而本申请的smallRNACG文库的构建无需此步骤；2)DNACG文库的构建方案中3’和5’接头是在同一个反应体系中，同时连接到建库片段的两端，而本申请的smallRNA文库的构建3’和5’接头是分两个反应体系分别连接到建库片段的两端，并且，本申请的一种实现方式中所采用的3’和5’接头是本申请人特别针对smallRNA自主设计合成的；3)DNACG文库的构建连上接头后需立刻进行缺口平移的反应再进行PCR扩增，而本申请的smallRNACG文库的构建无需进行缺口平移的反应，只需将连上接头的文库片段经反转录后再进行PCR扩增即可；4)DNACG文库的构建在PCR扩增后即可进行单链分离处理，而本申请的smallRNACG文库的构建则需先利用非变性PAGE胶纯化回收PCR扩增产物后再进行单链分离处理。其中，3’和5’接头分两个反应体系分别连接到建库片段的两端，是因为，本申请的3’端接头的序列还充当了标签序列的原因，先让目标序列与3’端反应可以确保两者反应更加充分，避免了由于5’端接头的影响造成的标签序列与目标序列不能充分结合导致后续扩增时产生大量不合格序列。本申请采用非变性PAGE胶纯化回收PCR扩增产物，是因为在PCR扩增后得到的PCR扩增产物等位基因片段大小存在很大的差距，如不纯化，可能会存在很多不含有标签序列的扩增产物，这些不能用于后续的实验。而一般的琼脂糖凝胶电泳的分辨率低，只能分别0.5-25kb的DNA片段，smallRNA的分子量很小，琼脂糖凝胶电泳很可能无法分离，因此本申请特别选用了分辨率更高的非变性PAGE胶纯化。但构建文库时，对分子量大小没有严格要求，只需提取出DNA分子即可，因此普通纯化即可。优选的，步骤(4)中，纯化回收PCR扩增产物采用的是非变性PAGE胶；步骤(6)中，回收酶切消化后的产物，采用的是磁珠法。本申请的另一面公开了一种用于smallRNACG文库建库的试剂盒，包括CG文库3’接头和CG文库5’接头；CG文库3’接头为SEQIDNO.1所示序列，CG文库5’接头为SEQIDNO.2所示序列；SEQIDNO.1:5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCnnnnnnnnnnGAGCTTGTC-3’SEQIDNO.2:5’-UCCUAAGACCGCUUGGCCUCCGACUU-3’其中，n可重复的选自A、G、C或T。需要说明的是，SEQIDNO.1所示序列的CG文库3’接头中，“nnnnnnnnnn”表示10bp的Barcode序列。本申请的CG文库3’接头和CG文库5’接头是特别针对smallRNA设计的，可以很好的适用于smallRNACG文库构建。优选的，CG文库3’接头为以下四种核苷酸片段中的至少一种，四种核苷酸片段依序为SEQIDNO.6至SEQIDNO.9所示序列。SEQIDNO.6：5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCATAAGGCAGTGAGCTTGTCT-3’SEQIDNO.7：5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCTTGATAGATTGAGCTTGTCT-3’SEQIDNO.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种small RNA的文库构建方法，其特征在于：包括以下步骤；(1)将small RNA片段与CG文库的3’接头连接；(2)将步骤(1)的产物与CG文库的5’接头连接；(3)将步骤(2)的产物反转录成cDNA；(4)对步骤(3)获得的cDNA进行PCR扩增，并纯化回收PCR扩增产物；(5)对纯化回收PCR扩增产物进行单链分离，并将获得的单链DNA环化；(6)对单链DNA环化的产物进行酶切消化，并回收酶切消化后的产物，即获得所述small RNA CG文库。

【技术特征摘要】
1.一种smallRNA的文库构建方法，其特征在于：包括以下步骤；(1)将smallRNA片段与CG文库的3’接头连接；(2)将步骤(1)的产物与CG文库的5’接头连接；(3)将步骤(2)的产物反转录成cDNA；(4)对步骤(3)获得的cDNA进行PCR扩增，并纯化回收PCR扩增产物；(5)对纯化回收PCR扩增产物进行单链分离，并将获得的单链DNA环化；(6)对单链DNA环化的产物进行酶切消化，并回收酶切消化后的产物，即获得所述smallRNACG文库。2.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中，纯化回收PCR扩增产物采用的是非变性PAGE胶；所述步骤(6)中，回收酶切消化后的产物，采用的是磁珠法。3.一种用于smallRNACG文库建库的试剂盒，其特征在于：包括CG文库3’接头和CG文库5’接头；所述CG文库3’接头为SEQIDNO.1所示序列，所述CG文库5’接头为SEQIDNO.2所示序列；SEQIDNO.1:5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCnnnnnnnnnnGAGCTTGTC-3’SEQIDNO.2:5’-UCCUAAGACCGCUUGGCCUCCGACUU-3’其中，n可重复的选自A、G、C或T。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述CG文库3’接头为以下四种核苷酸片段中的至少一种，四种核苷酸片段依序为SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵鑫，周鑫兰，吴逵，侯勇，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44