一种基于三嗪环结构限定性N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉抗原、抗体及应用制造技术

本发明专利技术一种基于三嗪环结构限定性N‑(2‑胍基‑乙亚氨基)‑吗啉半抗原、人工抗原、抗体及应用。所述N‑(2‑胍基‑乙亚氨基)‑吗啉半抗原的结构如式I所示：

【技术实现步骤摘要】
一种基于三嗪环结构限定性N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉抗原、抗体及应用
本专利技术属于药物残留分析检测
更具体地，涉及一种基于三嗪环结构限定性N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原、人工抗原、抗体及应用。
技术介绍
N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉盐酸盐(MoroxydineHydrochloride，简称盐酸吗啉胍，俗称“病毒灵”)，其核心有效成分为N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉，分子式为C6H13N5O·HCl，分子量为207.66。由于N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉能有效降低或抑制病毒的DNA聚合酶、RNA聚合酶的活性和蛋白质的合成等，其作为一种非核苷类广谱抗病毒药物，不仅广泛的应用于治疗流感、疱疹和水痘等病毒引起的疾病，在养殖业和种植业病毒性疾病防治方面应用也较多。2014年，西安、吉林等地曝光了多起“病毒灵”事件，引起了人们对该药物的广泛关注。事件的起因主要是幼儿长期服用盐酸N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉片，导致不少学生出现了腹痛、心慌、皮痒、呕吐、头晕等状况，严重者还会出现心悸、低血糖、呼吸急促、寒颤等反应。由此可知，盐酸N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉作为抗病毒药仍然有其疗效不确切，处方是否合理等问题。目前可以从烟草、糙米、番茄、蜂蜜和动物组织等中检测到N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉的残留，另外，在环境土壤中的残留情况也不太乐观，这些情况不仅会导致耐药性病毒的增加，而且为人们的健康埋下了安全隐患。因此对动植物源性食品和环境中N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉残留的检测具有重要意义。目前，对于药品和食品中N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉的传统的检测方法，大多依靠常规仪器分析方法，如高效液相色谱法、液相色谱-电喷雾串联质谱法等方法。这些方法存在周期长、专业性强，费用高等缺点，难以满足现场快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。基于抗原-抗体特异性识别的酶联免疫分析方法(ELISA)具有快速、灵敏、准确等优点，特别适用于现场进行高通量检测。另外，ELISA因其能弥补仪器法的上述不足，已在食品安全检测中发挥了重要作用。而ELISA法对于抗原、免疫原的选择要求较高，小分子化合物(MW≤1000Da)一般不具有免疫原性，不能直接免疫动物产生特异性抗体，但可与抗体产生反应，即具有反应原性。如果将小分子连接到具有免疫原性的大分子(通常为蛋白质)上，做成人工抗原，就可能使机体产生免疫应答，产生针对小分子结构的抗体。因为不是任何小分子与大分子载体连接都能产生特异性抗体，所以小分子半抗原结构的设计非常重要。建立酶联免疫分析方法的关键在于其半抗原和人工抗原的设计和合成。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉检测技术存在的存在周期长、专业性强、成本高，不适宜现场大批量快速检测，以及无法实现N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉的直接快速检测等问题、缺陷和不足，提供一种基于三嗪环结构限定性N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原，同时提供由所述半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及免疫实验动物后使机体产生特异的针对N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉的抗体；可用于N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉的检测，检测效率高、操作简便。本专利技术的目的是提供一种N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原。本专利技术另一目的是提供一种N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉人工抗原。本专利技术另一目的是提供一种N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉抗体。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原，结构如式I所示：其中R为-H和-CH3。当R为-H时，所述的N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原的结构如式Ia所示：当R为-CH3时，所述的N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原的结构如式Ib所示：所述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原(Ia和Ib)的制备方法如下：(1)N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原Ia的制备方法，包括以下步骤：在碳酸钾存在下，先将N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉盐酸盐解离出盐酸以制备N-(2-胍基-亚胺甲基)-吗啉a，再与甲醇钠/甲酸乙酯反应得到N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原Ia，其反应式为：(2)N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原Ib的制备方法，包括以下步骤：在甲醇钠存在下，先将N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉盐酸盐解离出盐酸以制备N-(2-胍基-亚胺甲基)-吗啉a，再与乙酸乙酯反应得N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原Ib，其反应式为：在上述半抗原IaN-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原Ia的制备方法中的关键因素：(1)碳酸钾与N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉盐酸盐的摩尔比为：1:1.2，溶剂蒸馏水，室温搅拌，产物需经减压旋蒸除去水相，再经甲醇溶解、过滤以除去杂质氯化钾和多余的碳酸钾，最终蒸干滤液可得N-(2-胍基-亚胺甲基)-吗啉a；(2)所述的N-(2-胍基-亚胺甲基)-吗啉a、甲醇钠、甲酸乙酯的摩尔比为1:1.5:3，溶剂THF，60℃搅拌反应36h，期间用TLC监控，产物需柱层析分离提纯。在上述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原Ib的制备方法中的关键因素：(1)甲醇钠和N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉盐酸盐的摩尔比为1:0.6～0.7，溶剂THF，室温搅拌，得到粗产物N-(2-胍基-亚胺甲基)-吗啉a，产物不经处理直接进入下一步反应；(2)乙酸乙酯与上步中甲醇钠的摩尔比为2:1，乙酸乙酯与适量无水THF混合后边搅拌边滴加到粗产物N-(2-胍基-亚胺甲基)-吗啉a中，滴加完毕后，冷凝回流，期间用TLC监控，产物需柱层析分离提纯。另外，所述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原在制备N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉人工抗原方面的应用，也在本专利技术的保护范围之内。一种N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉人工抗原，是由所述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原与载体蛋白偶联得到。所述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉人工抗原的结构式如式Ⅱ结构：具体人工抗原具有式Ⅱa和式Ⅱb结构：优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)，其中，BSA用于制备免疫原，OVA用于制备包被原。更优选地，所述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉人工抗原采用采用戊二醛法制备，具体步骤包括：将权利要求1所述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原溶于PBS缓冲溶液，与含有10mg/mL载体蛋白的PBS缓冲溶液混合，搅拌过程中逐滴加入适量的2.5％的戊二醛水溶液，室温避光反应3h，4℃用PBS透析2天，每天更换透析液3次，得到N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉人工抗原，分装，并低温保存备用；所述的N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原与载体蛋白的的摩尔比为40-100:1。更优选地，所述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉人工抗原的制备方法为：将N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原溶于PBS缓冲溶液(0.01M，pH7.4)中，与含有10mg/mL载体蛋白的PBS缓冲溶液混合，搅拌过程中逐滴加入适量的2.5％的戊二醛水溶液，室温避光反应3h，4℃用PBS透析2天，每天更换透析液3次，得到N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉人工抗原，分装，并低温保存备用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种N‑(2‑胍基‑乙亚氨基)‑吗啉半抗原，其特征在于，结构如式I所示：

【技术特征摘要】
1.一种N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原，其特征在于，结构如式I所示：其中R为-H和-CH3。2.一种权利要求1所述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原的制备方法，其特征在于，方法如（1）或（2）：（1）包括以下步骤：在碳酸钾存在下，先将N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉盐酸盐解离出盐酸以制备N-(2-胍基-亚胺甲基)-吗啉a，再与甲醇钠/甲酸乙酯反应得到N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原Ia，其反应式为：（2）包括以下步骤：在甲醇钠存在下，先将N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉盐酸盐解离出盐酸以制备N-(2-胍基-亚胺甲基)-吗啉a，再与乙酸乙酯反应得N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原Ib，其反应式为：。3.权利要求1所述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原在制备N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉人工抗原方面的应用。4.一种N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉人工抗原，其特征在于，是由权利要求1所述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半抗原与载体蛋白偶联得到。5.根据权利要求4所述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵清蛋白。6.根据权利要求4所述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉人工抗原，其特征在于，采用戊二醛法制备，具体步骤包括：将权利要求1所述N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉半...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉栋，邹婷婷，杨金易，徐振林，王弘，肖治理，罗林，雷红涛，孙远明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44