基于二维外源荧光光谱结合主成分分析检测生鲜乳掺还原乳的方法技术

本发明专利技术属于食品安全检测技术领域，具体为一种基于二维外源荧光光谱技术结合主成分分析检测生鲜乳掺还原乳的方法。本发明专利技术使用二维外源荧光检测技术，采集实验用纯生鲜乳和实验用纯生鲜乳经掺杂不同含量还原乳得到的掺杂生鲜乳样品的激发和发射波长的荧光图谱；结合主成分分析，得到主成分得分图，建立标准样品数据图谱库。将未知生鲜乳样品进行同样步骤的检测，将检测结果与标准样品数据图谱比对，最终实现检测生鲜乳是否掺还原乳的目的。本发明专利技术方法成本低廉、操作简单快速，每个样品测定时间只需0.5min，结果稳定，准确度高，在牛乳品质检测中具有潜在的应用推广前景。

【技术实现步骤摘要】
基于二维外源荧光光谱结合主成分分析检测生鲜乳掺还原乳的方法
本专利技术属于食品安全快速检测
，尤其涉及一种使用荧光探针并基于二维外源荧光光谱技术结合主成分分析(PCA)检测生鲜乳掺还原乳的方法。
技术介绍
还原乳又称“还原奶”或者“复原乳”,是将生鲜乳经浓缩和干燥等过程将其变成浓缩粉或者干燥乳粉，再按照生鲜乳的标准，向其中添加适当比例的水等配制成外观与生鲜乳无异的样品，由于极其相似的蛋白组成，配制成的还原乳可以达到以假乱真的目的。但因还原乳经高温加工，使其中的主要组分如蛋白质和碳水化合物遭到严重破坏，从而使其营养和功能价值大幅度降低。此种还原乳掺假生鲜乳的行为不仅欺骗消费者的知情权，也对乳品行业产生不良影响，因此急需开发对还原乳实现快速无损检测的方法。荧光检测技术是一种检测效果灵敏的技术。专利技术专利申请CN107367494A公开了一种运用内源荧光光谱技术检测区分还原乳和生鲜乳的方法。其基于三维激发发射光谱的三维网格图谱的内源性荧光无损检测技术，涵盖样品的整体荧光信息，从而达到区分还原乳和生鲜乳的目的。上述方法具有良好的重现性。但其对低掺量(如掺0.5％还原乳)的还原乳与生鲜乳的区分并不十分显著。另一方面，由于牛乳中含有丰富的蛋白组成，当使用非共价结合的染料作为蛋白质构象分析的荧光探针试剂时，因染料对所处环境的极性非常敏感，它们可吸附到蛋白质上，从而发出很强的荧光。如8-苯胺-1-萘磺酸(8-Anilino-1-naphthalenesulfonicacid，1,8-ANS)，其可结合到牛血清蛋白或者变性蛋白上，并发出很强的荧光。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种使用二维外源荧光检测生鲜乳掺还原乳的方法；其利用荧光探针与生鲜乳和/或还原乳中的蛋白结合发出强烈荧光的性质，使其荧光信号增强，再结合计量学从而达到高准确度区分两者的目的。本专利技术利用1,8-ANS荧光探针与生鲜乳和/或还原乳结合，从而提高荧光信号，再通过酶标仪测试样品的二维荧光图谱，结合主成分分析来测定生鲜乳和/或还原乳，从而建立无损快速检测技术。本专利技术的技术方案具体介绍如下。本专利技术提供了一种基于二维外源荧光光谱技术结合主成分分析(PCA)检测生鲜乳掺还原乳的方法，其包括如下步骤：S10：建立标准样品数据图谱库，其包括：S101：样品制备：分别以实验用纯生鲜乳和实验用纯生鲜乳经掺杂不同含量还原乳得到的掺杂生鲜乳样品为研究对象，按照比例加入荧光探针，并混合均匀；S102：二维荧光图谱采集：通过二维荧光光谱技术，使用酶标仪采集实验用纯生鲜乳和掺杂生鲜乳的二维激发发射荧光图谱；S103：主成分分析：采用数据分析软件通过降维实现实验用纯生鲜乳和掺杂生鲜乳在二维空间分布规律的可视化，得到主成分得分图和载荷图；S104：标准样品数据图谱库建立：选取S102中的二维激发发射荧光图谱和S103中的主成分得分图作为标准样品数据图谱库；S20：未知生鲜乳样品检测，其包括：S201：将未知生鲜乳样品按步骤S101～S103进行检测，获得未知生鲜乳样品的二维激发发射荧光图谱和主成分得分图；S202：将S201得到的未知生鲜乳样品的二维荧光图谱与标准样品数据图谱库中的二维荧光图谱进行比对，将S201得到的未知生鲜乳样品的主成分得分图与标准样品数据图谱库中的主成分得分图进行比对，可得知该未知生鲜乳样品中是否掺假。本专利技术的步骤S101中，所述的荧光探针为8-苯胺-1-萘磺酸(1,8-ANS)，1,8-ANS加入量与实验用纯生鲜乳或掺杂生鲜乳的体积比为1:4。本专利技术的步骤S102中，采用酶标仪，激发波长设置为375nm，发射波长设置为400～600nm，步长设置为2nm，激发和发射的带宽设置为5nm，增益值(gain)设置为80，进行二维荧光扫描采集相应数据，得到二维激发发射荧光图谱。本专利技术的步骤S101和S102中的所有实验均避光操作。本专利技术的步骤S103中，所述的数据分析软件为MATLABR2017a软件。和现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术方法只需简单的前处理(只需加入低剂量的1,8-ANS)后即可直接用于检测；(2)每个样品的检测时间短，仅为0.5min；(3)本专利技术方法包涵待测样品的大部分荧光信息，且因为荧光数据是二维的，只需简单的主成分分析即可达到区分的目的；(4)本专利技术方法检测结果稳定性好，准确度高；(5)本专利技术方法成本低廉，具有潜在的应用推广价值。附图说明图1为实验用纯生鲜乳和掺杂0.5％，1％，3％，5％及10％R品牌奶粉的二维荧光图谱。图2为实验用纯生鲜乳和还原乳的主成分得分图。图3为主成分1的载荷图图4为主成分2的载荷图图5为加入未知还原乳后所有样品的主成分得分图具体实施方式下面结合附图和实例对本专利技术进一步阐述。具体实施步骤如下：实施例1S10：建立标准样品数据图谱库S101：样品制备：将来源于山东青岛牧场采集的-23℃的生鲜乳，在常温放置，待解冻后作为实验用纯生鲜乳。将购自于京东超市的M，Y，N，R品牌的奶粉按照0.5％，1％，3％，5％，10％(w/v)的比例添加到已解冻的生鲜乳中得到掺杂生鲜乳(M，Y，N，R每个品牌分别按五种不同掺加量加入)，涡旋1min，超声20min至充分溶解。将荧光染料1,8-ANS使用pH＝7.4磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)配置成100μM的溶液，采用磁力搅拌在暗处混匀4h，待溶液完全，将母液稀释10倍备用。取上述已准备好的实验用纯生鲜乳和/或掺杂生鲜乳80μL置于96孔板中，向其中加入20μL1,8-ANS荧光探针液，测定之前摇晃10min，使混合均匀，待测。S102：二维荧光图谱采集：启动TecaninfiniteM1000Pro酶标仪，在Fluorescenceintensityscan模式，激发波长设置为375nm，发射波长设置为400～600nm，步长设置为2nm，激发和发射的带宽设置为5nm，增益值(gain)设置为80。在此同一条件下，采集所有样品的二维激发发射荧光光谱。S103：主成分分析：将采集到的二维光谱数据从Excel数据导入到MATLABR2017a统计分析软件，编码PCA分析程序，扣除96孔板的1,8-ANS空白荧光值，分别做PCA得分图和载荷图。主成分分析(PCA)通过线性变换而使数据压缩达到降维的目的。PCA的输出结果为得分图和载荷图，根据PCA得分图，可以得到掺假乳和还原乳的全局可视化分析。得分图可表明样品的类型及样品之间的相关性和不同性，而载荷图用于解释变量之间的关系。通常选择前两个主成分，因为其两者的贡献率可以最大程度解释数据的方差。S104：标准样品数据图谱库建立：本实施例中建立的标准样品数据图谱库的部分图谱如图1,2所示。从图1可以看出，掺杂0.5％还原乳后的掺杂生鲜乳具有两个明显的荧光峰，最大的发射波长为464和518nm，而其他更高掺杂比例的掺杂生鲜乳，也具有相同的发射波长，但其荧光信号更高，且随着掺杂比例的增加而增加。为直接观察所有实验用纯生鲜乳和掺杂生鲜乳分布情况，将二维荧光图谱和计量学手段如主成分结合分析，从而更直观和准确地反映生鲜乳掺假的情况。将得到的120×101(样品×发射波长数)荧光数据集从Excel导入MAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于二维外源荧光光谱结合主成分分析检测生鲜乳掺还原乳的方法，其特征在于，包括如下步骤：S10：建立标准样品数据图谱库，其包括：S101：样品制备：以实验用纯生鲜乳和实验用纯生鲜乳经掺杂还原乳得到的掺杂生鲜乳为研究对象，分别加入荧光探针混合均匀；S102：二维荧光图谱采集：通过二维荧光光谱技术，使用酶标仪采集实验用纯生鲜乳和掺杂生鲜乳的二维激发发射荧光图谱；S103：主成分分析：采用数据分析软件通过降维实现实验用纯生鲜乳和掺杂生鲜乳在二维空间分布规律的可视化，得到主成分得分图；S104：标准样品数据图谱库建立：选取S102中的二维激发发射荧光图谱和S103中的主成分得分图建立标准样品数据图谱库；S20：未知生鲜乳样品检测，其包括：S201：将未知生鲜乳样品按步骤S101～S103进行检测，获得未知生鲜乳样品的二维激发发射荧光图谱和主成分得分图；S202：将S201得到的未知生鲜乳样品的二维荧光图谱与标准样品数据图谱库中的二维荧光图谱进行比对，将S201得到的未知生鲜乳样品的主成分得分图与标准样品数据图谱库中的主成分得分图进行比对，可得知该未知生鲜乳样品中是否掺假。

【技术特征摘要】
1.一种基于二维外源荧光光谱结合主成分分析检测生鲜乳掺还原乳的方法，其特征在于，包括如下步骤：S10：建立标准样品数据图谱库，其包括：S101：样品制备：以实验用纯生鲜乳和实验用纯生鲜乳经掺杂还原乳得到的掺杂生鲜乳为研究对象，分别加入荧光探针混合均匀；S102：二维荧光图谱采集：通过二维荧光光谱技术，使用酶标仪采集实验用纯生鲜乳和掺杂生鲜乳的二维激发发射荧光图谱；S103：主成分分析：采用数据分析软件通过降维实现实验用纯生鲜乳和掺杂生鲜乳在二维空间分布规律的可视化，得到主成分得分图；S104：标准样品数据图谱库建立：选取S102中的二维激发发射荧光图谱和S103中的主成分得分图建立标准样品数据图谱库；S20：未知生鲜乳样品检测，其包括：S201：将未知生鲜乳样品按步骤S101～S103进行检测，获得未知生鲜乳样品的二维激发发射荧光图谱和主成分得分图；S202：将S201得到的未知生鲜乳样品的二维荧光图谱与标准样品数据图谱库中的二维荧光图谱进行比...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆维盈，杜丽娟，牛宇戈，张亚琼，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31