甲藻中提取抗氧化肽的方法技术

本发明专利技术提供了甲藻中提取抗氧化肽的方法，提取方法包括：调浆、脱蛋白、初次酶解、二次酶解、纯化、干燥，提取所得的抗氧化肽的分子量范围为5~10KD，二次酶解操作为：取初次酶解液，加入1700~2500U/g胃蛋白酶水解13~18min，加入胃蛋白酶重量1~4‰的乙酸2‑羟基‑1,2,2‑三苯基乙酯，继续反应13~18min，酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活10~15min，静置取上清液，得二次酶解液，该方法操作简单，效率高，成本低，提取过程中酶结构稳定、酶解效果好，所提取的抗氧化肽活性强。

Extraction of antioxidant peptides from methylene algae

The invention provides a method for extracting antioxidant peptides in alga. The extraction methods include: pulping, deproteinized, first enzymolysis, two enzymolysis, purification and drying. The molecular weight range of the extracted antioxidant peptide is 5~10KD, and the two enzyme hydrolysates are taken as the first enzyme solution, adding the 1700~2500U/g pepsin to hydrolyze 13~18min and add the hydrolysate. 2% of acetic acid was added to the pepsin 1~4, three hydroxyethyl acetate and three phenyl ethyl ester, and continued to react to 13~18min. In the process of enzymatic hydrolysis, the enzyme solution was assisted by two frequency compound ultrasound and microwave radiation alternately, and the enzyme solution was completed by boiling water bath to inactivate 10~15min, and the supernatant was statically removed, and two enzymatic hydrolysates were obtained. This method was simple and efficient. The cost is low, the enzyme structure is stable and the enzymolysis effect is good during the extraction process, and the extracted antioxidant peptide has strong activity.

【技术实现步骤摘要】
甲藻中提取抗氧化肽的方法
本专利技术属于抗氧化肽提取
，具体涉及甲藻中提取抗氧化肽的方法。
技术介绍
甲藻是指具有双鞭毛的单细胞集合群植物，形状不定。常分布于淡水和海水中，有些甲藻的活动是有害的，它们的生存会带有一些特殊的气味。有的则可以形成“红潮”和“藻花”，使局部海水呈现红色、黄色或棕色。主要繁殖方法是细胞分裂，每个子细胞各为母细胞的一半，另外的一半由子细胞自己发育；或是在母细胞体内产生2个或偶为多个能运动的游动孢子，或不能运动的不动孢子；此外，休眠型的芽胞也有发现。有性生殖仅在少数属种中发现。活性肽(英文ActivePeptide)，活性肽是一千多种肽的总称（如大豆肽，深海鱼皮肽，海参肽等是活性肽中的一种）。肽是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，在人体内起重要生理作用，发挥生理功能。具有活性的多肽称为活性肽，又称生物活性肽或生物活性多肽。抗氧化肽在食品、化妆品等行业中的应用越来越多，市场需求量在逐步扩大，如何实现简便快速的提取一直是抗氧化肽发展过程中的重要环节。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种甲藻中提取抗氧化肽的方法，该方法操作简单，效率高，成本低，提取过程中酶结构稳定、酶解效果好，所提取的抗氧化肽活性强。本专利技术为解决上述技术问题所采取的方案为：甲藻中提取抗氧化肽的方法，提取方法包括：调浆、脱蛋白、初次酶解、二次酶解、纯化、干燥，提取所得的抗氧化肽的分子量范围为5~10KD，二次酶解操作为：取初次酶解液，加入1700~2500U/g胃蛋白酶水解13~18min，加入胃蛋白酶重量1~4‰的乙酸2-羟基-1,2,2-三苯基乙酯，继续反应13~18min，酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活10~15min，静置取上清液，得二次酶解液。上述提取方法过程简单，提取效率高，可操作性强，提取所得的抗氧化肽活性高，可用于抗氧化活性成分，二次酶解操作中条件控制适宜，酶解效果好，其中的乙酸2-羟基-1,2,2-三苯基乙酯中的（R）-乙酸2-羟基-1,2,2-三苯基乙酯和（S）-乙酸2-羟基-1,2,2-三苯基乙酯的重量比为1:0.7，加入的乙酸2-羟基-1,2,2-三苯基乙酯在较强酸性环境下可发生二聚合、三聚合反应，聚合产物和与胃蛋白酶产生亲电作用，防止微波辐射过程影响胃蛋白酶的空间结构，稳定胃蛋白酶的结构性质，防止其活性降低，提升酶解效率和酶解效果。作为优选，双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解的操作为：开启双频率超声波40~45秒，关闭超声波，开启微波辐射3~8秒，关闭微波辐射；开启双频率超声波33~42秒，关闭超声波，开启微波辐射7~13秒，关闭微波辐射，循环操作。以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性，节约提取成本。作为优选，调浆操作为：按重量份计，取35~60份甲藻粉溶于水，常温下磁力搅拌8~17min，后在-35℃~-25℃中冷冻40~60min，置于3~5℃下解冻，反复冻融至少一次，得甲藻浆。反复冻融可加速甲藻中细胞破裂，提升后续对甲藻内容物的提取，降低后续操作的条件控制。作为优选，脱蛋白操作为：取浓度为5~7%的TCA溶液，向甲藻浆中加入TCA溶液，甲藻浆与TCA溶液的体积比为1:0.8~1.3，进行2~6次的脱蛋白操作，得去蛋白浸提液。采用TCA法脱蛋白操作简便，成本低，条件的优良控制可使得在除蛋白效果好的情况下，抗氧化肽的损失率也低。作为优选，初次酶解的操作为：取去蛋白浸提液，加入2800~3700U/g碱性蛋白酶，水解1.0~2.5h后水浴灭酶；加入酶解液0.77~0.89倍的蒸馏水，调节温度为40~48℃、pH7.0~7.3，加入4300~5500U/g木瓜蛋白酶，水解1.5~2.5h后水浴灭酶，得初次酶解液。提取过程中采用多次酶解，可有效提高甲藻浆的酶解程度，提升提取率。作为优选，纯化操作为：取二次酶解液，在5000~7000g、3~5℃下，经截留分子量为10KD的超滤离心管中过滤，滤液再经过5KD的超滤离心管过滤，即可获得分子量大小为5~10KD的甲藻抗氧化肽溶液。该纯化步骤所得的抗氧化肽的抗氧化能力强。作为优选，干燥操作为：取纯化后的溶液在42~51℃、真空度为0.07~0.09MPa下浓缩，后在进风温度为105~120℃、出风温度为65~80℃下进行喷雾干燥，得抗氧化肽。喷雾干燥对抗氧化肽活性影响小，干燥速度快。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为:1）以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性；2）加入的乙酸2-羟基-1,2,2-三苯基乙酯在较强酸性环境下可发生二聚合、三聚合反应，聚合产物和与胃蛋白酶产生亲电作用，防止微波辐射过程影响胃蛋白酶的空间结构，稳定胃蛋白酶的结构性质，防止其活性降低，提升酶解效率和酶解效果。具体实施方式以下结合实施例作进一步详细描述：实施例1：甲藻中提取抗氧化肽的方法，提取方法包括：1）调浆：按重量份计，取35份甲藻粉溶于水，常温下磁力搅拌8min，后在-25℃中冷冻40min，置于3℃下解冻，反复冻融2次，得甲藻浆。反复冻融可加速甲藻中细胞破裂，提升后续对甲藻内容物的提取，降低后续操作的条件控制；2）脱蛋白：取浓度为5%的TCA溶液，向甲藻浆中加入TCA溶液，甲藻浆与TCA溶液的体积比为1:0.8，进行2次的脱蛋白操作，得去蛋白浸提液。采用TCA法脱蛋白操作简便，成本低，条件的优良控制可使得在除蛋白效果好的情况下，抗氧化肽的损失率也低；3）初次酶解：取去蛋白浸提液，加入2800U/g碱性蛋白酶，水解1.0h后水浴灭酶；加入酶解液0.77倍的蒸馏水，调节温度为40℃、pH7.0，加入4300U/g木瓜蛋白酶，水解1.5后水浴灭酶，得初次酶解液。提取过程中采用多次酶解，可有效提高甲藻浆的酶解程度，提升提取率；4）二次酶解：取初次酶解液，加入1700U/g胃蛋白酶水解13min，加入胃蛋白酶重量1‰的乙酸2-羟基-1,2,2-三苯基乙酯，继续反应13min，酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活10min，静置取上清液，得二次酶解液，二次酶解操作中条件控制适宜，酶解效果好，其中的乙酸2-羟基-1,2,2-三苯基乙酯中的（R）-乙酸2-羟基-1,2,2-三苯基乙酯和（S）-乙酸2-羟基-1,2,2-三苯基乙酯的重量比为1:0.7，加入的乙酸2-羟基-1,2,2-三苯基乙酯在较强酸性环境下可发生二聚合、三聚合反应，聚合产物和与胃蛋白酶产生亲电作用，防止微波辐射过程影响胃蛋白酶的空间结构，稳定胃蛋白酶的结构性质，防止其活性降低，提升酶解效率和酶解效果；双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解的操作为：开启双频率超声波40秒，关闭超声波，开启微波辐射3秒，关闭微波辐射；开启双频率超声波33秒，关闭超声波，开启微波辐射7秒，关闭微波辐射，循环操作。以双频率超声与微波辐本文档来自技高网...

【技术保护点】
甲藻中提取抗氧化肽的方法，其特征在于：所述的提取抗氧化肽的方法包括：调浆、脱蛋白、初次酶解、二次酶解、纯化、干燥，提取所得的抗氧化肽的分子量范围为5~10KD，所述的二次酶解操作为：取初次酶解液，加入1700～2500U/g胃蛋白酶水解13~18min，加入胃蛋白酶重量1~4‰的乙酸2‑羟基‑1,2,2‑三苯基乙酯，继续反应13~18min，酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活10~15min，静置取上清液，得二次酶解液。

【技术特征摘要】
1.甲藻中提取抗氧化肽的方法，其特征在于：所述的提取抗氧化肽的方法包括：调浆、脱蛋白、初次酶解、二次酶解、纯化、干燥，提取所得的抗氧化肽的分子量范围为5~10KD，所述的二次酶解操作为：取初次酶解液，加入1700～2500U/g胃蛋白酶水解13~18min，加入胃蛋白酶重量1~4‰的乙酸2-羟基-1,2,2-三苯基乙酯，继续反应13~18min，酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后沸水浴灭活10~15min，静置取上清液，得二次酶解液。2.根据权利要求1所述的甲藻中提取抗氧化肽的方法，其特征在于：所述的双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解的操作为：开启双频率超声波40~45秒，关闭超声波，开启微波辐射3~8秒，关闭微波辐射；开启双频率超声波33~42秒，关闭超声波，开启微波辐射7~13秒，关闭微波辐射，循环操作。3.根据权利要求1所述的甲藻中提取抗氧化肽的方法，其特征在于：所述的调浆操作为：按重量份计，取35~60份甲藻粉溶于水，常温下磁力搅拌8~17min，后在-35℃~-25℃中冷冻40~60min，置于3~5℃下解冻，反复冻融至少一次，得甲藻浆。4.根据权利要求1所述的甲藻中提...

【专利技术属性】
技术研发人员：李冰，
申请(专利权)人：浦江县欧立生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33