用于测定真菌菌株对于抗真菌剂的敏感性程度的方法技术

本发明专利技术涉及用于测定真菌菌株对于抗真菌剂的敏感性程度的方法。

Method for determining the sensitivity of fungal strains to antifungal agents

The invention relates to a method for determining the sensitivity of a fungal strain to an antifungal agent.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测定真菌菌株对于抗真菌剂的敏感性程度的方法本专利技术涉及测定真菌菌株对于抗真菌剂的敏感性程度的方法。自20世纪80年代以来，真菌被认为是在人类中的病理学状况的主要来源。由各种不同的酵母物种引起的侵入性念珠菌病是美国医院内血液感染的第四大原因，并且与大约40％的死亡率相关联。这些败血病主要与免疫抑制、手术动作或侵入性动作有关。对于抗真菌分子具有抗性的菌株(尤其是在假丝酵母属物种(Candidaspp.)酵母中)出现的增加导致增长的临床失败。抗性分离物的准确且快速的表征已成为大的担忧之一，以便在感染开始后尽可能快速地按照菌株的表型来调整治疗。目前可用的对于抗真菌剂的敏感度的测试基于对在抗真菌剂存在下真菌生长的抑制进行评价，并且使得能够测定最小抑制浓度(MIC)。然后，该值可以相对于由临床和实验室标准学会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI)和欧洲抗微生物易感性测试委员会(EuropeanCommitteeonAntimicrobialSusceptibilityTesting，EUCAST)所定义的临床阈值(临床转折点，CBP)而言来进行阐释。这些临床阈值使得能够建立真菌菌株的敏感表型、抗性表型或中间表型，并因此预测患者对于抗真菌治疗的应答，以便根据感染性菌株的表型来调整抗真菌治疗。用于测定MIC的CLSI或EUCAST参考方法基于微量稀释，并因而不适合于常规临床实践。更易于实施的其他测试已被开发出来，并且被商业化以用于医学用途。FungitestTM(Biorad)是在以两种不同浓度的六种抗真菌剂(两性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑和咪康唑)存在下，从细胞悬浮液开始进行的用于测定酵母菌株的敏感度的方法。它以包含具有所述抗真菌剂的孔的微量培养板的形式存在。它使得能够在将微量培养板温育48至72小时并使其与氧化还原指示剂相接触后通过比色读取来测定所述菌株的敏感度。SensititreYeast(TrekDiagnosticsSystems)是用于酵母菌株(也包括假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)和曲霉属(Aspergillus)物种)的敏感度的体外诊断并且为了伏立康唑、卡泊芬净、阿尼芬净和米卡芬净而开发的方法。该方法以包含孔的微量培养板的形式存在，并且使得能够从微量稀释开始并在根据物种将微量培养板温育24至72小时后借助于比色指示剂来测定MIC。(Biomérieux)是为了包括抗生素、抗真菌剂、抗分枝杆菌剂、抗微生物剂的多于100种参考分子而开发的用于测定微生物(细菌、真菌)的MIC的方法。它以包含预先确定的15种抗真菌剂或抗生素浓度的指数梯度(其被施加在经接种的琼脂平皿上)的小条带的形式存在。在大约24小时的温育后，通过读取在小条带上所指出的并且相应于抑制椭圆的边缘的值来目视测定MIC的值。抑制椭圆与小条带之间的该交叉点指明了受试分子抑制微生物生长时所处的浓度。方法由于其实施的简单性而在常规上是最多使用的。Vitek2(Biomérieux)是用于细菌或酵母的鉴定和抗菌素效能检定的自动化系统，其从在液体培养基中的接种物开始并且使用包含各种不同比色测试的反应孔的平板。它使得能够在3至7小时的时间内同时鉴定微生物和测定相关于一种或多种抗真菌剂或抗生素的该微生物的MIC(Ling等人,2003,EvaluationoftheVITEK2SystemforRapidDirectIdentificationandSusceptibilityTestingofGram-NegativeBacillifromPositiveBloodCultures)。还开发了使用流式细胞术和细胞生存力染料的方法，其主要用于假丝酵母属物种。这些方法显示出了与CLSI和EUCAST参考方法的良好相关性，但仅对于几种特定的“抗真菌剂-物种”对。已通过例如麦角固醇合成的定量而创立了化学测试。大多数商业化的敏感度测试基于用于测定给定菌株的MIC的比色测试或生长测试。结果的目视阐释可以是错误的来源，其中知晓在唑类存在下生长的延缓效应也可以使测试的阐释出错并且相应于在抑制区中的最小生长。所有现有的测试都具有缺点，其中最大的缺点是测试的反应时间(至少24小时)和结果读取的主观性。因此，由于各种不同真菌物种的抗性的增加的发展，需要制定使得能够测定真菌菌株对于抗真菌剂的表型的更快速且更可靠的新型测试，以便在感染开始后尽可能快速地调整治疗。在通常用于构成治疗基础的抗真菌剂之中，尤其选中棘白菌素类的类别，其包括米卡芬净、卡泊芬净和阿尼芬净。该抗真菌剂类别直接作用于真菌的壁。它们通过结合至β-1,3-葡聚糖合酶来抑制细胞壁的β-1,3-葡聚糖的合成，所述β-1,3-葡聚糖合酶是与膜相结合并且由调节亚基(Rho)和催化亚基(Fks)组成的酶，因而对于其的抑制导致壁形成的抑制。棘白菌素类的主要备选物为具有抑制在细胞膜中存在的固醇类合成的作用的抗真菌剂。在它们之中，选中唑类或唑类抗真菌剂的类别，其尤其包括氟康唑、泊沙康唑、伏立康唑和伊曲康唑，它们是最常使用的。唑类抗真菌剂靶向细胞色素P450-Erg11p(也称为Cyp51p)，其牵涉麦角固醇(其是真菌膜的主要组分)的生物合成途径。麦角固醇合成途径的阻断导致有毒性的甲基化固醇的产生和在细胞膜中的损害。唑类已显示，它们导致作为补偿现象的壁蛋白质产生的增加，这暗示唑类不仅是细胞膜的抑制剂，而且还是细胞壁的抑制剂。基本上由两性霉素B所代表的多烯类具有强的毒性。还使用嘧啶类作为抗真菌剂，但是由于对于嘧啶类似物的抗性的发展而往往与另一类别的抗真菌剂相组合地进行使用。因此，唑类和棘白菌素类的作用机制牵涉细胞膜和/或细胞壁。一些胁迫反应的信号传导途径，例如PKC(蛋白激酶C)途径、HOG(高摩尔渗透压浓度甘油)途径、MAPK(MAP激酶)途径和钙依赖磷酸酶途径，响应于壁胁迫而被激活，并且协调几丁质合成的增加以便补偿对于细胞壁和/或细胞膜所引起的损害。在CostadeOliveira等人的出版物(2013)中，作者观察到某些具有在高卡泊芬净浓度(大于MIC)下进行生长的能力的酵母物种在其细胞壁中也具有高数量的几丁质。Walker等人(2013)已描述了在棘白菌素类存在下真菌反常生长的效应，其在当用卡泊芬净进行处理时最经常地突然发生。因此，它们已显示，在低浓度下和在非常高的浓度下抑制了白假丝酵母(C.albicans)的生长，但在中等浓度下观察到生长。本专利技术的方面之一是提供用于测定真菌菌株的敏感性程度的可靠测试。本专利技术的另一个方面是提供用于测定真菌菌株的敏感性程度的可靠测试，其反应时间少于48小时，甚至24小时，和更特别地6.5小时。本专利技术的另一个方面是提供用于测定真菌菌株的敏感性程度的可靠测试，其阐释是客观的，不经受延缓效应。本专利技术的另一个方面是提供在临床上可使用的用于测定真菌菌株敏感性程度的可靠测试。本专利技术的目标在于在真菌菌株的细胞群中的几丁质含量的可能变化用于测定所述真菌菌株对于抗真菌剂的敏感性程度的用途，所述变化相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量而言来进行测定。专利技术人已发现，几丁质含量的本文档来自技高网...

【技术保护点】
在真菌菌株的细胞群中的几丁质含量的可能变化用于测定所述真菌菌株对于抗真菌剂的敏感性程度的用途，所述变化相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量而言来进行测定，并且其中所述敏感性程度相应于所述真菌菌株对于抗真菌剂的要么敏感表型、要么抗性表型、要么中间表型。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.15 FR 15/014891.在真菌菌株的细胞群中的几丁质含量的可能变化用于测定所述真菌菌株对于抗真菌剂的敏感性程度的用途，所述变化相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量而言来进行测定，并且其中所述敏感性程度相应于所述真菌菌株对于抗真菌剂的要么敏感表型、要么抗性表型、要么中间表型。2.根据权利要求1的在真菌菌株的细胞群中的几丁质含量的可能变化用于测定所述真菌菌株对于抗真菌剂的敏感性程度的用途，和所述真菌菌株的细胞群的细胞数目的可能变化用于测定所述真菌菌株对于抗真菌剂的敏感性程度的用途，所述细胞数目的可能变化相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的细胞数目而言来进行测定，并且其中所述真菌为单细胞真菌。3.根据权利要求1和2的在真菌菌株的细胞群中的几丁质含量的可能变化的用途，所述真菌为单细胞真菌：-其中所述真菌菌株对于所述抗真菌剂的抗性表型通过相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量而言小于10％的几丁质含量的增加或者几丁质含量的减少或者不变的几丁质含量来确定，并且其中在所述真菌菌株的所述细胞群中表现出几丁质含量增加的细胞的最小阈值为至少10％，尤其是20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％；或者-其中所述真菌菌株对于所述抗真菌剂的中间表型以下述方式来确定：要么通过相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量而言10％至小于20％的值的几丁质含量的增加，要么通过相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量而言大于或等于20％的几丁质含量的增加，和通过相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的细胞数目而言小于0.3log的细胞数目的减少或者不变的细胞数目，并且其中在所述真菌菌株的所述细胞群中表现出几丁质含量增加的细胞的最小阈值为至少10％，尤其是20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％，和任选地，其中在所述真菌菌株的所述细胞群中细胞数目减少的最小阈值为至少0.3log，尤其是0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3；或者-其中所述真菌菌株对于所述抗真菌剂的敏感表型通过相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量而言大于或等于20％的几丁质含量的增加，和通过相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的细胞数目而言至少0.3log的细胞数目的减少来确定，并且其中在所述真菌菌株的所述细胞群中表现出几丁质含量增加的细胞的最小阈值为至少10％，尤其是20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％，和其中在所述真菌菌株的所述细胞群中细胞数目减少的最小阈值为至少0.3log，尤其是0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3。4.根据权利要求1至3的在真菌菌株的细胞群中的几丁质含量的可能变化用于测定所述真菌菌株对于抗真菌剂的敏感性程度的用途，其中所述几丁质含量的可能变化通过荧光，尤其是通过荧光显微术方法，更特别地通过高图像内容自动显微术(HCA)来进行测定，并且其中所述几丁质含量的可能变化尤其借助于荧光标记物，尤其是钙荧光白来进行测定。5.根据权利要求1至4的在真菌菌株的细胞群中的几丁质含量的可能变化用于测定所述真菌菌株对于抗真菌剂的敏感性程度的用途，其中所述抗真菌剂选自没有多烯类例如两性霉素B和制霉菌素且没有对于几丁质具有直接作用的抗真菌剂的抗真菌剂的组，更特别地：-选自包括下列各项或由下列各项组成的组：唑类抗真菌剂例如氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑和艾莎康唑，或其他抑制麦角固醇合成的分子例如烯丙胺类，其中包括特比萘芬或吗啉类；或者-选自棘白菌素类，所述棘白菌素更特别地选自包括下列各项或由下列各项组成的组：阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净。6.根据权利要求1至5的在真菌菌株的细胞群中的几丁质含量的可能变化用于测定所述真菌菌株对于抗真菌剂的敏感性程度的用途，其中所述真菌为酵母，并且其中酵母的细胞群选自包括下列属或由下列属组成的组：假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、糖酵母属(Saccharomyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、红酵母属(Rhodotorula)、鳞斑霉属(Malassezia)，和更特别地，其中假丝酵母属的酵母选自包括下列物种或由下列物种组成的组：白假丝酵母(Candidaalbicans)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、克鲁斯假丝酵母(C.krusei)、都柏林假丝酵母(C.dubliniensis)、乳酒假丝酵母(C.kefyr)、葡萄牙假丝酵母(C.lusitaniae)、涎沫假丝酵母(C.zeylanoides)、皱落假丝酵母(C.rugosa)、平常假丝酵母(C.inconspicua)、挪威假丝酵母(C.norvegensis)、季氏假丝酵母(C.guilliermondii)、产朊假丝酵母(C.utilis)。7.用于测定真菌菌株的细胞群对于抗真菌剂的敏感性程度的方法，所述方法包括测定在抗真菌剂存在下在所述真菌菌株的细胞群中的几丁质含量相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量而言的可能变化的步骤，其中所述敏感性程度相应于敏感表型、抗性表型或中间表型。8.根据权利要求7的用于测定真菌菌株的细胞群对于抗真菌剂的敏感性程度的方法，所述方法包括测定在抗真菌剂存在下在所述真菌菌株的细胞群中的几丁质含量相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量而言的可能变化的步骤，并且其中所述真菌为单细胞真菌。9.根据权利要求7和8的用于测定真菌菌株的细胞群对于抗真菌剂的敏感性程度的方法，所述真菌为单细胞真菌，所述方法包括测定在抗真菌剂存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量而言的可能变化的步骤，和测定在抗真菌剂存在下在所述真菌菌株的所述细胞群中的细胞数目的可能变化的步骤，所述细胞数目的变化相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的细胞数目而言来进行测定。10.根据权利要求7至9的用于测定真菌菌株的细胞群对于抗真菌剂的敏感性程度的方法：-其中所述敏感性程度相应于抗性表型，并且所述方法包括测定在抗真菌剂存在下在所述真菌菌株的细胞群中的几丁质含量的可能变化的步骤，所述可能变化为相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量而言小于10％的几丁质含量的增加或者几丁质含量的减少或者不变的几丁质含量，并且其中在所述真菌菌株的所述细胞群中表现出几丁质含量增加的细胞的最小阈值为至少10％，尤其是20％、25％、3...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·P·R·莫兰阿尔德贝，M·M·J·科尔内吉古，
申请(专利权)人：格勒诺布尔阿尔卑斯大学，格勒诺布尔大学中心医院，
类型：发明
国别省市：法国,FR