一种毛细管电泳的质谱联用定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种毛细管电泳的质谱联用定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法及应用，步骤是：S1.血清样品的处理：取血清样品加入磷脂酰胆碱内标物，直接加入甲醇，冰上孵育，离心，转移上清，氮气吹干保存，CE‑MS定量检测前用甲醇溶解，离心去上清准备毛细管电泳进样；所述内标物为磷脂酰胆碱17:0/14:1、MW 717.996；S2.毛细管电泳条件；S3.质谱条件；S4.定量分析：根据标准品溶液的浓度及峰面积，做线性回归，得线性方程；再根据此方程及检测所得的峰面积，计算出血清样品中磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的浓度。该方法在检测阿兹海默病中的应用。采用多级反应监测模式MRM对血清中PC/LPC进行相对定量分析，排除大量干扰离子，检测限达0.0001ng/μL，重现性好，回收率和检测灵敏度较高。

Quantitative analysis of phosphatidylcholine in serum by mass spectrometry coupled with capillary electrophoresis and its application

The present invention discloses a method and application of a capillary electrophoresis mass spectrometry for quantitative analysis of phosphatidylcholine in serum. The procedure is: the treatment of serum samples in S1.: Taking serum samples into phosphatidylcholine internal standard, adding methanol directly, incubating on ice, centrifugation, transfer supernatant, nitrogen blowing and preservation, and quantitative detection of CE MS Before using methanol to dissolve, centrifugal supernatant preparation was prepared by capillary electrophoresis; the internal standard was phosphatidylcholine 17:0/14:1, MW 717.996; S2. capillary electrophoresis conditions; S3. mass spectrometry conditions; S4. quantitative analysis: linear regression was obtained according to the concentration and peak area of standard solution, and linear equation was obtained; and then based on this equation and detection unit The concentration of phosphatidylcholine and lysophosphatidylcholine in serum samples was calculated. This method is used in the detection of Alzheimer's disease. The multilevel reaction monitoring model MRM was used to analyze the serum PC/LPC relative quantitative analysis, excluding a large number of interfering ions, the detection limit was 0.0001ng/ mu L, the reproducibility was good, the recovery rate and the detection sensitivity were high.

【技术实现步骤摘要】
一种毛细管电泳的质谱联用定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法及应用
本专利技术属于定量分析
，更具体涉及一种CE-MS定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法，同时还涉及一种毛细管电泳的质谱联用(CE-MS)定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法的用途。
技术介绍
阿兹海默病(Alzheimerdisease，AD)又称阿尔兹海默病、老年痴呆症、老人失智症、脑退化症等，是一种持续性神经功能障碍，也是失智症中最普遍的成因。早期最显著的症状为健忘，通常表现为逐渐增加的短期记忆缺失，而长期记忆则相对不受病情的影响。随着病情的加重，病人的语言能力、空间辨别能力、认知能力会逐步衰退。阿兹海默病主要分为家族性阿兹海默病与阿兹海默老年痴呆症两种，其中又以后者较常见。在AD病的致病因素中，虽然一些特定的基因突变(如Presenilin-1，Presenilin-2和APP基因)是可以直接造成AD，但由于基因突变引起的AD只占AD病例的极少部分。往往只有当阿兹海默病患者死亡之后才能诊断出他们患有此病，因为只有对大脑中中枢神经细胞的损失情况和衰退情况(脑组织的减少情况或者萎缩情况)进行检查后才能对这种病做出诊断，非常不利于阿兹海默病的早期诊断和有效预防。因此，有必要提出一种能够通过早期检测来诊断阿兹海默病的方法。有研究显示，胆固醇水平与AD病之间存在某种关联，胆固醇代谢异常、24S-羟基胆固醇水平的改变、脂蛋白a的不同亚型和水平变化、ApoE对胆固醇代谢的调节以及ApoE自身与Aβ的相互作用等已经被证实与痴呆的发生有密不可分的关系。脂类对细胞质膜的结构和功能整体性起着重要的作用，膜脂非随机分布，而是分布在不同部位。这些部位由面朝胞外和面朝胞浆的片层、胆固醇池、环状脂类和脂筏组成。许多流行病学研究表明高血清胆固醇浓度与AD的发病率增加有一定的关联，然而AD患者脑内是否有胆固醇的合成和代谢改变尚不清楚。磷脂(PL)并非单一的化合物，而是含有磷酸基和多种脂质的一类物质的总称，血清中PL包括：卵磷脂(60％)和溶血卵磷脂(2％-10％)，磷脂酰乙醇胺(2％)，鞘磷脂(20％)。磷脂的主要功能是维持正常完整的细胞膜，在早期的阿兹海默病分子病理学中细胞膜磷脂就会发生变化，并且可以为阿兹海默病染色体丢失提供分子基础。磷脂酰胆碱(PC)是主要的真核细胞膜磷脂，所占磷脂比例接近40％，含有磷脂的胆碱是细胞膜完整性的基本要素。由于氧化作用产生的磷脂病理学故障不可避免的反映出由PC的分解代谢产物如溶血磷脂酰胆碱(lyso-PC，LPC)等的变化，溶血磷脂酰胆碱(LPC)和磷脂酰胆碱(PC)的改变和两者比值的细微变化都会导致细胞消亡。一些研究发现蛋白和脂质的氧化作用直接影响了大脑区域从而诱发阿兹海默病(AD)。然而现有的分析方法中，ESI-MS直接定量法前处理简单，所需样品少，用时短，但是灵敏度较低，难以分析丰度较低的脂质，而且加入的不挥发性Li+作为缓冲盐容易导致离子源污染，缩短质谱仪使用寿命。因此，提出一种新的血清中磷脂酰胆碱的检测方法非常有必要。毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，CE)是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，被认为是一种高速、高效的物质分离方法，特别在分析复杂的生物样品和样品量极少时，CE具有独特的优越性。但是，CE有限的进样量也对检测器的灵敏度提出了很高的要求，传统的紫外光度检测器灵敏度不高、选择性差，无法给出样品的结构信息。质谱(MassSpectrometry，MS)即用电场和磁场将运动的离子按其质荷比分离后进行检测的方法。与传统的紫外光度检测器相比，质谱除了可以提供分子质量信息外，还可以提供未知组分的结构信息，具有很高的选择性和灵敏度。将CE和MS联用可以实现高效分离和高灵敏度、多结构信息的检测。近几年，关于CE-MS方法学研究的报道比较多，主要是关于新接口技术的研究，使得CE-MS的联用更加方便，效率更高；还有的报道集中在CE-MS在各领域的应用，如环境分析、食品药品分析、生物大分子及其相关物质分析、中草药及其他天然产物活性毒性成分分析、代谢组学研究及生物标志物筛选等。然而，目前还没有一种利用CE-MS联用分析血清中磷脂，进而判断其与阿兹海默病发病关联性的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术中的不足，本专利技术提供了一种毛细管电泳的质谱联用(CE-MS)定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法，将CE和MS联用可以实现对血清中的不同种类磷脂以及不同碳链长度和不饱和度的磷脂酰胆碱(PC)和溶血磷脂酰胆碱(LPC)的高效分离和高灵敏度、多结构信息的检测。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种毛细管电泳的质谱联用(CE-MS)定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法在检测阿兹海默病中的应用。目前通过遗传基因组学、蛋白质组学、代谢组学、分子生物学等高科技技术手段探阿兹海默病的发病病因机制和通路，寻找脑内小分子生物活性致病因子是研究热门，在阿兹海默病早期发现、早期诊断领域探索小分子活性生物标志物的研究越来越得到重视，磷脂是机体内重要的生物活性物质，是信息分子前体的贮备形式，其代谢产物可以通过影响人体内分泌或神经来调节人体代谢，改善记忆障碍，提高记忆功能。人体内磷脂对脑细胞的再生、活化、衰老起着关键的作用，血清中磷脂代谢异常可能是导致阿兹海默病发生的一个重要因素，所以精确定量分析血清中磷脂酰胆碱是对阿兹海默病早期诊断的一个重要途径之一。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。一种毛细管电泳的质谱联用(CE-MS)定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法，包括如下步骤：S1.血清样品的处理：取血清样品加入磷脂酰胆碱内标物，直接加入甲醇，冰上孵育，离心，转移上清，氮气吹干保存，毛细管电泳的质谱联用(CE-MS)定量检测前用甲醇溶解，离心去上清准备毛细管电泳进样；所述内标物为磷脂酰胆碱17:0/14:1、MW717.996；S2.毛细管电泳条件：电泳缓冲液中氯仿:甲醇为2:1、含10mM醋酸铵，未涂层熔融二氧化硅毛细管为分离通道，压力0.4-0.6psi进样，分离电压为25kV，分离时间9－11min；S3.质谱条件：离子源ESI源，电喷雾电压+5200V，碰撞气体8，气帘气10，雾化气压力0.15－0.25MPa，辅助气流速0，碰撞气6，离子化温度0，去簇电压130V，射入电压10V，碰撞室射出电压15V；S4.定量分析：取浓度梯度范围为0.01～1ng/μL的磷脂酰胆碱标准品加入所述内标物，与S1处理后的血清样品在相同的条件下进行CE-MS定量检测，根据标准品溶液的浓度及峰面积，做线性回归，得线性方程；再根据此线性方程及检测所得的峰面积，计算出血清样品中磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的浓度；所述标准品为磷脂酰胆碱17:0/14:1、MW717.996，磷脂酰胆碱12:0/13:0、MW635.853，磷脂酰胆碱17:0/20:4、MW796.108。本专利技术通过毛细管电泳CE结合电喷射离子化串联质谱MS对不同血清样品中不同分子结构的PC和LPC分别定量。在PC和LPC的提取方法上，比较了氯仿/甲醇提取体系和甲醇直接抽提法，发现甲醇直接抽提法的回收率和检测灵敏度更优。同时，优化了本专利技术定量分析方法的毛细管电泳及质谱条件，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种毛细管电泳的质谱联用定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法，它包括下列步骤：S1.血清样品的处理：取血清样品加入磷脂酰胆碱内标物，直接加入甲醇，冰上孵育，离心，转移上清，氮气吹干保存，毛细管电泳的质谱联用定量检测前用甲醇溶解，离心去上清准备毛细管电泳进样；所述的内标物为磷脂酰胆碱17:0/14:1、MW 717.996；S2.毛细管电泳条件：电泳缓冲液中氯仿:甲醇为2:1、含10mM醋酸铵，未涂层熔融二氧化硅毛细管为分离通道，压力0.4‑0.6psi进样，分离电压为25kV，分离时间9－11min；S3.质谱条件：离子源ESI源，电喷雾电压+5200V，碰撞气体8，气帘气10，雾化气压力0.15－0.25MPa，辅助气流速0，碰撞气6，离子化温度0，去簇电压130V，射入电压10V，碰撞室射出电压15V；S4.定量分析：取浓度梯度范围为0.01～1ng/μL的磷脂酰胆碱标准品加入所述内标物，与S1处理后的血清样品在相同的条件下进行CE‑MS定量检测，根据标准品溶液的浓度及峰面积，做线性回归，得线性方程；再根据线性方程及检测所得的峰面积，计算出血清样品中磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的浓度；所述标准品为磷脂酰胆碱17:0/14:1、MW 717.996，磷脂酰胆碱12:0/13:0、MW 635.853，磷脂酰胆碱17:0/20:4、MW 796.108。...

【技术特征摘要】
1.一种毛细管电泳的质谱联用定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法，它包括下列步骤：S1.血清样品的处理：取血清样品加入磷脂酰胆碱内标物，直接加入甲醇，冰上孵育，离心，转移上清，氮气吹干保存，毛细管电泳的质谱联用定量检测前用甲醇溶解，离心去上清准备毛细管电泳进样；所述的内标物为磷脂酰胆碱17:0/14:1、MW717.996；S2.毛细管电泳条件：电泳缓冲液中氯仿:甲醇为2:1、含10mM醋酸铵，未涂层熔融二氧化硅毛细管为分离通道，压力0.4-0.6psi进样，分离电压为25kV，分离时间9－11min；S3.质谱条件：离子源ESI源，电喷雾电压+5200V，碰撞气体8，气帘气10，雾化气压力0.15－0.25MPa，辅助气流速0，碰撞气6，离子化温度0，去簇电压130V，射入电压10V，碰撞室射出电压15V；S4.定量分析：取浓度梯度范围为0.01～1ng/μL的磷脂酰胆碱标准品加入所述内标物，与S1处理后的血清样品在相同的条件下进行CE-MS定量检测，根据标准品溶液的浓度及峰面积，做线性回归，得线性方程；再根据线性方程及检测所得的峰面积，计算出血清样品中磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的浓度；所述标准品为磷脂酰胆碱17:0/14:1、MW717.996，磷脂酰胆碱12:0/13:0、MW635.853，磷脂酰胆碱17:0/20:4、MW796.108。2.根据权利要求1所述的一种CE-MS定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法，其特征在于：所述的线性方程采用的标准品为磷脂酰胆碱17:0/14:1、MW717.996。3.根据权利要求2所述的一种CE-MS定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡锐，杨运煌，张许，刘买利，
申请(专利权)人：中国科学院武汉物理与数学研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42