校正质谱检测核酸样品的准确率的方法及产品技术

本发明专利技术提供了一种通过改善核酸样本二次结晶的方法，包括在乙腈水溶液中分别加入3‑羟基‑2‑吡啶甲酸、柠檬酸二胺溶液以配制基质溶液，然后加入特定比例的样本溶液在芯片上进行点样结晶。本发明专利技术还提供了提高质谱检测核酸靶分子的准确率的质谱校正方法，包括在具有多个竖直交叉排列的亲水区域定位孔、疏水孔外区域、中心校正孔、验证校正孔、备用校正孔的芯片上，分别点样基质溶液结晶，点样核酸样本并结晶，并通过质谱轰击校正孔位的核酸样本，以对待测样本的质谱结果进行校正。本发明专利技术还提供了适用上述质谱校正和检测的芯片。本发明专利技术改进基质溶液配方，能够获得结晶形态较佳的一次结晶和二次结晶效果，其校正方法有助于获得更加稳定和准确的质谱检测结果。

【技术实现步骤摘要】
校正质谱检测核酸样品的准确率的方法及产品
本专利技术涉及一种通过改善生物样本结晶及校正方式来提高MALDI-TOF质谱检测正确率的方法，能质谱检测核酸分子，属于质谱检测

技术介绍
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)技术已成为目前蛋白质组学研究中的经典技术。在该技术的成功应用过程中,合适的样品前处理方法起着首要和关键的作用。只有将合适的样品前处理方法与合适的有机基质结合起来,才能成功实现对核酸和蛋白质等生物大分子的准确鉴定。对于基质、溶剂、盐(金属离子)和样品制备方法的选择是MALDI分析高聚物成败的关键因素。最优化的条件是使样品分子和基质均匀地形成共结晶。MALDI方法分析大分子,重要的关键之一是选择合适的基质。结果表明,效果较佳的基质只有几种。水溶性合成高分子如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇经常出现于早期的MALDI研究中,这是因为分析多肽的基质也可以应用于它们,对于另外一些高分子,可以从高分子和基质的溶解性中找到一些选择基质的思路。一般来说,选择基质时应使基质与高分子的极性比较一致,彼此之间具有兼容性。微阵列芯片以高密度阵列为特征。微阵列技术就是利用分子杂交原理,使同时被比较的标本与微阵列杂交，通过检测杂交信号强度及数据处理，把他们转化成不同标本中特异基因的丰度，从而全面比较不同标本的基因表达水平的差异。微阵列芯片因其高度均一性，结构稳定性，样品用量少及高通量而成为芯片领域中发展最迅速的一部分。微阵列不仅仅在生物遗传领域有着广泛的用途，在其他定量和相对定量分析方面也有着潜在的用途。微阵列芯片因其微孔尺寸相同，微孔与周围亲疏水性质的差别，较好的限制了样品所处的范围，使得所分析的区域保持一致，使定量分析成为可能。质谱成图因为其无需标记，无需分离，通过对图像的分析来进行混合物中组成物质的定量分析，使多组分的同时检测成为可能，因此利用微阵列芯片中质谱成图进行多组分的同时定量分析，是一种具有广泛应用前景的定量分析技术。微阵列芯片中质谱成图在定量分析中的应用很大程度上取决于样本结晶的均一性，由于质谱数据采集中的质量歧视，质谱图的峰高或峰面积无法作为样品的定量分析的依据，因此如何获得可靠的，稳定的定量数据就显得尤为重要。在应用MALDI-TOFMS时，通常将生物样本与一种饱和的低分子量无机化合物溶液(称为基质)进行混合加在靶板上，待干后样本与基质共结晶后形成了以基质包裹构架的样本固体沉淀。样本基质结晶体经激光辐射，基质从激光中吸收能量，能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，使样品吸附，基质与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，离子在加速电场下获得相同的动能，经高压加速、聚焦后进入飞行时间检测器。根据离子飞行时间的不同进行分析得出离子质荷比(m/z)和离子峰值，形成质量图谱，检测准确性高。通过软件分析比较,筛选并确定出特异性指纹图谱,从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定。MALDI-TOFMS可用于分析多种类型的样本,包括有机分子溶液、核酸、蛋白质以及整个微生物,其中基因、蛋白质和微生物是目前在临床质谱检测实验室应用最广的项目。基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-TOFMS)离子源可电离相对分子质量为100～1000000的生物分子，通过高压电与短激光脉冲作用，让基质晶体升化，使基质与样本分子气化进入质谱仪的气相，其最突出的特点是准分子离子化很强、对样本中杂质的耐受量大，直接分析核酸、蛋白质经电离产生的混合物，能为临床检验中标准物质的研究提供有效的技术保障，是临床检验的参考方法的首选。因此芯片上的样本结晶形态和质量好坏直接影响质谱的检定结果。在提高芯片的样本结晶形态和质量的研究中，现有的研究重点在于如何改进芯片的质量。例如，中国授权专利201410090967.3、“制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法”提供了一种通过在芯片上设置疏水和亲水区域来制备检测芯片，其中采用丝网印刷技术将疏水性聚合物(聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯)按照设计好的模板刷在导电玻璃上，其中涂布区为疏水区，空白区作为预留的亲水区。然后，用亲水材料(如样品体系的水溶液)涂布空白区，形成均一间隔的亲水区和疏水区。该方法通过利用丝网印刷技术来设计模板形状，预先在亲水区留出空白区(又称“留白处理”)，因此需要特殊的印刷设备和操作软件，同时在涂布疏水区时靶板要绝对静置。同时，丝网印刷技术的精度低，亲疏水区域的分界不能达到微米精度。并且，需要将待测混合物体系水溶液均匀地铺在亲水区，芯片烘干固化，置于烘箱中60摄氏度固化2h，增加了生产时间和成本。中国授权专利201110401165.6、“对生物样品进行富集和除盐净化处理的方法”公开了一种利用疏水和亲水材料制备具有封闭图案化表面的检测靶板的方法，包括通过在基底上构筑具有较大直径的聚合物涂层(如聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯或光刻胶)作为挡层圆区，然后以含氟单分子层或蒸镀金属层作为疏水层贴在整个基底上。由于该疏水层不能粘附在上述挡层圆区，因此将靶板浸入有机溶剂中进行超声处理，可以除去挡层圆区。最后，再将所述聚合物涂层在所述圆区内部突变较小直径的同心圆，从而获得疏水外圈(含氟单分子层或蒸镀金属层)-亲水中圈-疏水内圈(聚合物涂层)的同心圆图案的质谱靶板，因此该方法又称“挡层涂布”。然而，该方法在基底上构筑疏水-亲水-疏水区域的封闭图案化表面，需要进行两步疏水处理，即采用含氟的试剂在100～250℃下加热生长1～5个小时，工艺复杂，过程耗时。由于该方法需要精确控制两次聚合物涂层的间距，间距过小导致外圈和内圈相连，同时由于使用两种不同的疏水材料来分别突变不同的基底表面，所获得的疏水区液滴的接触角过小，导致疏水效果差，影响了普通实验室的应用。中国专利申请200610023671.5、公开了“一种低丰度蛋白靶上一步除盐与富集的方法”，其中通过疏水聚合物(聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氟乙烯等)预先在靶板的样品池中央部分进行涂布，然后进行蛋白点样，使得蛋白样品富集在疏水聚合物层上。然后，将基质溶液加入点样区，使得蛋白样品中的污染物和无机盐扩散出去，最后得到样品和基质均匀细致的结晶。由于该方法是直接将蛋白样品加到疏水层，通过加入过量的基质溶液来进行纯化，虽然客观上有一定纯化效果，但造成了蛋白样品的浪费。同时，如果手动操作将0.2μl疏水性聚合物溶液点在每个Kapton膜的小孔内，耗时，且0.2μl溶液的精度难以控制，影响小孔表面疏水均一性；如果自动操作，需要配置相应点样设备，增加成本，制备复杂，并不适合不易制备的微量蛋白样品的检测和应用。由于上述靶板的在先研究中，或是靶板表面没有亲水疏水差异，(如中国专利200610023671.5)，导致结晶形态差，或是形成亲水疏水差异的涂层，但亲疏水分界不能达到微米精度或液滴接触角过小，但制备过程过于复杂，不能节约时间和成本(如中国专利201410090967.3、专利201110401165.6)，或是需要额外的装置和检测软件，或是需要过多的珍贵蛋白样本进行检测，这些都导致质谱检测样本峰的准确度低，信噪比低，基线高。在最接近的现有技术中，专利技术人在先前提交的中国专利(CN201710539756、用于飞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可提高质谱检测核酸靶分子的准确率的质谱校正方法，步骤包括：(1)配制基质溶液，并配置核酸靶分子样本以及校正样本UEP的溶液；(2)分别在亲水区域定位孔、中心校正孔以及验证校正孔，点0.5‑1μL基质溶液，自然挥干后形成一次结晶；(3)在亲水区域定位孔，在一次结晶表面，点0.5‑1μL核酸靶分子样本，自然挥干后形成二次结晶；(4)分别在中心校正孔、验证校正孔，在一次结晶表面，点0.5‑1μL校正样本UEP，自然挥干后形成二次结晶；(5)通过激光飞行时间质谱分别轰击中心校正孔位、验证校正孔的校正样本UEP，获得多个UEP峰分子量的谱图；(6)当90％的UEP峰分子量偏差小于200PPM，即为校正有效；(7)校正成功后，即可对亲水区域定位孔的待测核酸靶分子样本进行质谱检测。其中，步骤(1)中将乙腈水溶液中以1‑10：100(mg/ml)的比例，加入3‑羟基‑2‑吡啶甲酸充分溶解得到混合液，随后将3‑羟基‑2‑吡啶甲酸溶液和柠檬酸二胺溶液，按照1‑3:1体积比混合均匀，过滤即得基质溶液。

【技术特征摘要】
1.一种可提高质谱检测核酸靶分子的准确率的质谱校正方法，步骤包括：(1)配制基质溶液，并配置核酸靶分子样本以及校正样本UEP的溶液；(2)分别在亲水区域定位孔、中心校正孔以及验证校正孔，点0.5-1μL基质溶液，自然挥干后形成一次结晶；(3)在亲水区域定位孔，在一次结晶表面，点0.5-1μL核酸靶分子样本，自然挥干后形成二次结晶；(4)分别在中心校正孔、验证校正孔，在一次结晶表面，点0.5-1μL校正样本UEP，自然挥干后形成二次结晶；(5)通过激光飞行时间质谱分别轰击中心校正孔位、验证校正孔的校正样本UEP，获得多个UEP峰分子量的谱图；(6)当90％的UEP峰分子量偏差小于200PPM，即为校正有效；(7)校正成功后，即可对亲水区域定位孔的待测核酸靶分子样本进行质谱检测。其中，步骤(1)中将乙腈水溶液中以1-10：100(mg/ml)的比例，加入3-羟基-2-吡啶甲酸充分溶解得到混合液，随后将3-羟基-2-吡啶甲酸溶液和柠檬酸二胺溶液，按照1-3:1体积比混合均匀，过滤即得基质溶液。2.权利要求1的方法，其中选取0.75μL基质溶液和0.5μL靶分子样本或标准样本溶液进行结晶。3.权利要求2的方法，其中所述校正样本UEP是如表1所述的用于扩增靶核酸的引物，即耳聋UEP。4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述质谱的参数设置如下：Turingmode:linear；MassRange:3000-9000；MaxLaserRepRate:10.0；Powe...

【专利技术属性】
技术研发人员：马庆伟，梁飞，付书辉，梁坤，赵明辉，
申请(专利权)人：北京毅新博创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11