与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记，其位于PPARα基因上，具体核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1；在序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列中，当等位基因为A时，藏绵羊高原低氧适应性差；当等位基因为B时，藏绵羊高原低氧适应性良好。本发明专利技术以藏绵羊为研究对象，采用PCR‑SSCP方法结合DNA测序技术，研究2个绵羊群体PPARα基因的遗传变异特征，初步筛选出藏绵羊在高寒低氧适应性上的分子标记，为后续的相关性分析提供基础。

Genetic markers related to adaptability of Tibetan sheep to hypoxia at high altitude and their application

The present invention provides a genetic marker related to the adaptability of the Tibetan sheep plateau hypoxia, which is located on the PPAR alpha gene, and the specific nucleotide sequence is the SEQ ID No.1 in the sequence table; in the nucleotide sequence of the sequence table SEQ ID No.1, when the allele is A, the hypoxia adaptability of the Tibetan sheep plateau is poor; when the allele is B, the Tibetan sheep is high. The original hypoxic adaptability was good. With Tibetan sheep as the research object, the genetic variation characteristics of the 2 sheep population PPAR alpha gene were studied by PCR SSCP method combined with DNA sequencing technology, and the molecular markers of the Tibetan sheep in the alpine and hypoxic adaptability were preliminarily screened, which provided the basis for the follow-up correlation analysis.

【技术实现步骤摘要】
与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记及其应用
本专利技术属于基因工程及分子生物学
，具体涉及与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记及其应用。
技术介绍
青藏高原平均海拔4500m以上，具有低氧、寒冷、强紫外线等极端环境特征，在这种严酷自然环境条件下繁育的高原土著物种是我们开展动物适应性进化研究的优秀“素材”。野牦牛、藏绵羊、藏羚羊等高原土著动物经过漫长的适应性进化，不断地在形态、细胞和分子水平上形成了适应和调节机制。随着基因组学、生物信息学的快速发展，基于基因组学分析生物适应性进化的方法和工具也在不断完善，为探讨不同海拔之间动物基因组变异提供了有力支持。在基因组层面开展高原物种适应性进化研究成为热点，也成为揭示高原土著动物适应性进化分子机制的有效途径。藏绵羊作为中国三大粗毛绵羊品种之一(另包括蒙古羊和哈萨克羊)，主要分布于海拔2500-5000m的青藏高原地区，形成了对高原低氧极端环境独特的生理及遗传适应机制。近年来，由于自然环境和各种人为因素的影响，藏绵羊的生产性能、抗逆(病)性、适应能力等呈下降趋势。因此，研究藏绵羊的高原低氧适应机制，对于高原土著动物的遗传改良和种质资源保护利用具有重要意义。过氧化物酶体增殖物激活型受体(peroxisomeproliferatoractivated-receptors，PPARs)是一类配体激活的核转录调节因子，属于2型核受体家族成员。在啮齿类动物中最先被发现，根据结构的不同，分为PPARα、PPARβ、PPARγ3种亚型，分别位于人的22、6、3号染色体，编码468、441、479个氨基酸残基。PPARs结合配体活化与靶基因启动子区域中的过氧化物酶体增殖物反应元件(peroxisomeproliferatorresponseelement，PPRE)结合，影响一些与脂肪代谢有关的蛋白或酶基因的表达，进而参与调控机体能量代谢、脂肪代谢、胰岛素敏感、炎症反应、脂肪细胞的生长和分化等过程。PPARα基因多态性与动物高原低氧的适应性具有相关性。Simonson等人确定PPARα基因为高寒低氧适应候选基因，在机体能量代谢方面具有重要调控作用。如PPARα基因多态性与不同海拔埃塞俄比亚人的血红蛋白水平相关，并且参与HIF通路；坨坨河地区藏族人PPARα基因的单倍型与血清乳酸和脂肪酸的浓度呈现一定的相关性。在低氧、血液供应不足的情况下，大鼠PPARα基因表达的下调，减少了脂肪酸的氧化供能，提高葡萄糖的氧化来维持机体能量平衡，从而降低对心脏的损伤。藏绵羊是适应青藏高原低氧环境最典型的模式动物之一。截止目前，有关PPARα基因在藏绵羊高原低氧适应性的研究鲜见报道。
技术实现思路
本专利技术基于藏绵羊对藏区人民群众生活生产的重要性以及具有与藏族人相似的高原适应性进化过程，开展藏绵羊高原低氧适应分子标记筛选和适应性进化机制研究，通过检测哺乳动物HIF通路上的PPARα基因在藏绵羊上的耐氧SNPs及其组织表达情况，初步分析其高原低氧适应性进化特征，为藏绵羊耐低氧遗传改良提供基础数据。本专利技术的第一个目的是提供与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记，其位于PPARα基因上，具体核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.1；在序列表SEQIDNo.1的核苷酸序列中，当等位基因为A时，藏绵羊高原低氧适应性差；当等位基因为B时，藏绵羊高原低氧适应性良好；所述等位基因A为：在序列表SEQIDNo.1的核苷酸序列中，第99bp处的碱基为A，第111bp处的碱基为C；所述等位基因B为：在序列表SEQIDNo.1的核苷酸序列中，第99bp处的碱基为G，第111bp处的碱基为T。本专利技术的第二个目的是提供用于检测权利要求1所述的与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记的引物对，所述引物对为：上游引物：ATGTTCGCCCACAGTTTGAC下游引物：TGCTACGACTCTAGCTGACG。本专利技术的第三个目的是提供上述与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记在鉴定藏绵羊高原低氧适应性中的应用，所述应用包括以下步骤：(1)提取待测藏绵羊的基因组DNA；(2)以待测藏绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增；(3)检测PCR扩增产物，如果扩增序列中，等位基因为A，则藏绵羊高原低氧适应性差；等位基因为B，则藏绵羊高原低氧适应性良好；或者，检测PCR扩增产物，如果基因型为AA，则藏绵羊高原低氧适应性差；如果基因型为AB或者BB，则藏绵羊高原低氧适应性良好。作为优选，所述PCR扩增时的扩增体系以20μl计为：Taq预混酶10μL，去离子水7.6μL，上、下游引物和DNA模板各0.8μL。作为优选，所述PCR扩增时的PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，61.5℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃终延伸7min；4℃保存备用。作为优选，步骤(3)中，所述检测PCR扩增产物是采用SSCP检测，同时设置标准样，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和标准样结果对待测藏绵羊的高原低氧适应性进行判断。本专利技术的第四个目的是提供含有上述引物对的用于检测藏绵羊高原低氧适应性的试剂盒。本专利技术的第五个目的是提供与藏绵羊的高原低氧适应性相关的遗传标记在藏绵羊分子标记辅助育种中的应用。本专利技术以藏绵羊为研究对象，采用PCR-SSCP方法结合DNA测序技术，研究藏绵羊PPARα基因的遗传变异特征，初步筛选出藏绵羊在高寒低氧适应性上的分子标记，为后续的相关性分析提供基础。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为绵羊PPARα基因intron3-intron4PCR-SSCP检测结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例11试验材料与方法1.1实验动物及样品采集采集藏绵羊血样共340份。颈静脉采血8-10mL，肝素钠抗凝剂抗凝，实验室-20℃冻存备用。部分血液滴至FTA卡上晾干，常温保存。1.2试验方法1.2.1基因组DNA和总RNA提取基因组DNA提取：采用北京全式金生物技术有限公司的DNA提取试剂盒EasyBloodGenomicDNAKit和Zhou等描述的两步法提取血液基因组。1.2.2PPARα基因PCR扩增根据NCBI里提供的绵羊PPARα基因序列(登录号：NC_019460.2)，利用PrimerPrimer5.0和DNAMAN设计特异引物P1(表1)，引物由华大基因科技股份有限公司合成。表1引物P1信息PCR反应体系：总反应体系20μL，其中Taq预混酶10μL(南京诺唯赞生物科技有限公司)，去离子水(ddH2O)7.6μL，上、下游引物(浓度10pmol)和DNA模板(浓度50ng/ml)各0.8μL。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，61.5℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃终延伸7min；4℃保存备用。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。SSCP步骤：取PCR产物3.0μL本文档来自技高网...

【技术保护点】
与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记，其特征在于：其位于PPARα基因上，具体核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1；在序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列中，当等位基因为A时，藏绵羊高原低氧适应性差；当等位基因为B时，藏绵羊高原低氧适应性良好；所述等位基因A为：在序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列中，第99bp处的碱基为A，第111bp处的碱基为C；所述等位基因B为：在序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列中，第99bp处的碱基为G，第111bp处的碱基为T。

【技术特征摘要】
1.与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记，其特征在于：其位于PPARα基因上，具体核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.1；在序列表SEQIDNo.1的核苷酸序列中，当等位基因为A时，藏绵羊高原低氧适应性差；当等位基因为B时，藏绵羊高原低氧适应性良好；所述等位基因A为：在序列表SEQIDNo.1的核苷酸序列中，第99bp处的碱基为A，第111bp处的碱基为C；所述等位基因B为：在序列表SEQIDNo.1的核苷酸序列中，第99bp处的碱基为G，第111bp处的碱基为T。2.用于检测权利要求1所述的与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记的引物对，其特征在于：所述引物对为：上游引物：P1-up:ATGTTCGCCCACAGTTTGAC下游引物：P1-dn:TGCTACGACTCTAGCTGACG。3.权利要求1所述的与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记在鉴定藏绵羊高原低氧适应性中的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：(1)提取待测藏绵羊的基因组DNA；(2)以待测藏绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增；(3)检测PCR扩增产物，如果扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀，罗玉柱，李少斌，王继卿，张亚强，王凤璋，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62