一种核酸提取试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，涉及一种核酸提取试剂盒及其应用，所述试剂盒包括玻璃珠、蜗牛酶、裂解液和去除剂，所述裂解液中包括Tween‑40，所述去除剂中包括CTAB和Al2(SO4)3。本发明专利技术试剂盒可以高效破碎真菌细胞壁，且能够快速高效的获得高质量的真菌核酸。

A nucleic acid extraction kit and its application

The invention belongs to the field of molecular biology, involving a nucleic acid extraction kit and its application. The kit includes a glass bead, a snail enzyme, a lysate, and a remover. The lysate includes a Tween 40, including CTAB and Al2 (SO4) 3. The kit can efficiently break the cell wall of fungi, and can obtain high-quality fungal nucleic acids efficiently and efficiently.

【技术实现步骤摘要】
一种核酸提取试剂盒及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种核酸提取试剂盒及其应用，具体涉及一种用于真菌的核酸提取试剂盒及其应用。
技术介绍
真菌是一大类真核生物细胞型微生物。在自然界重分布广泛、种类繁多，目前已有一万个属、十万余种。其中绝大多数对人类有益，少数对人类有害，可引起人类及动植物的疾病。与医学有关的真菌达四百余种，常见的有50-100种，可引起人类感染性、中毒性及超敏反应性疾病。如：皮肤癣、花斑癣、肺炎、肠炎、过敏性皮炎等。目前，临床上常见真菌的检测方法主要是直接镜检和分离培养法，直接镜检法无法鉴定感染真菌的种类，而分离培养法培养时间长，受人员经验影响比较大，且形态比较接近的真菌也难以区分到种。因此通过分子生物学方法进行真菌鉴定显得越来越重要。但是真菌细胞壁成分复杂，由几丁质、甘露聚糖、葡聚糖组成，难以破碎，且真菌中富含多糖、色素等物质使得真菌核酸提取更加困难，从而限制了真菌分子鉴定方法的应用。因此，探索真菌核酸高效、快速提取方法十分重要。传统的真菌方法主要有CTAB法、SDS法、酶解法等，提取的步骤大体相似，关键是如何有效地裂解真菌细胞壁释放出核酸，有的是通过机械法破碎细胞壁，有的是通过酶来消化细胞壁。机械法目前主要是通过液氮冷冻干燥研磨破碎细胞壁，但这种方法也无法完全破碎细胞壁，而且这种方法大多会用到有毒有机溶剂、酚等，而且操作耗时较长，使用液氮容易冻伤皮肤，又受研钵数量的限制无法大量提取。酶解法消化细胞壁也存在得不到好的去壁效果，提取效率低的问题。基于上述问题，如何提取真菌的核酸，能够尽可能获得完整的核酸，提高提取的效率，缩短提取的时间，就成为亟待解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种核酸提取试剂盒及其应用，本专利技术试剂盒可以高效破碎真菌细胞壁，且能够快速高效的获得高质量的真菌核酸。第一方面，本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括玻璃珠、蜗牛酶、裂解液和去除剂。本专利技术中，专利技术人发现，采用蜗牛酶的加入可以分解真菌含有的多糖物质，更有利于核酸的释放，同时有利于多糖的去除，减少多糖对核酸的污染；玻璃珠机械破碎细胞壁和蜗牛酶消化破碎细胞壁相结合的方法，对细胞壁的破碎效率更好。根据本专利技术，所述裂解液中包括Tween-40，所述去除剂中包括CTAB和Al2(SO4)3。本专利技术中，所述Tween-40的添加提高了样本裂解效率，无需特定震荡破碎仪，普通涡旋仪即可操作，高效便捷，单个样品提取一般可在45min内完成；所述Al2(SO4)3的添加可有效吸附样本腐蚀质，所述CTAB对腐蚀质的吸附有一定能力，且在高盐浓度下，可有效去除样本中多糖类物质，通过这三个试剂的配合，提取得到的DNA纯度高，可直接用于后续分子实验。根据本专利技术，所述裂解液中还包括Tris-Cl缓冲液、EDTA或SDS中的任意一种或至少两种的组合，优选为包括Tris-Cl缓冲液、EDTA和SDS。根据本专利技术，所述去除剂中还包括NaCl。根据本专利技术，所述试剂盒还包括CTAB。根据本专利技术，所述试剂盒还包括缓冲液、悬浮液、结合液、漂洗液或洗脱液中的任意一种或至少两种的组合。根据本专利技术，所述试剂盒还包括离心吸附柱，所述离心吸附柱的硅基质膜为美国产millpore硅基质膜。。本专利技术中，专利技术人发现，采用所述硅基质膜柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好，克服了膜质量不稳定的弊端。本专利技术中，所述试剂盒各试剂的浓度在此不作限定，只需要这些试剂能达到使用时的浓度就可以，本领域技术人员可以根据需要调剂各个试剂的浓度。第二方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的试剂盒用于真菌核酸的提取。本专利技术中，所述核酸包括DNA和RNA，当提取DNA时，所述试剂盒中包括常规的RNA消化酶，当提取RNA时，所述试剂盒中包括常规的DNA消化酶，其他试剂并不会改变。第三方面，本专利技术提供一种真菌核酸的提取方法，采用如第一方面所述的试剂盒，包括如下步骤：(1)将样本与玻璃珠涡旋混匀，加入酶液酶解；(2)向步骤(1)的混合液中加入裂解液混合，重悬；(3)将步骤(2)重悬后的样本加入去除剂混匀，离心；(4)将步骤(3)离心后的样本加入结合液混匀，加入吸附柱中，离心，漂洗，加入75％的无水乙醇，离心；(5)将步骤(4)离心后的样本加入洗脱液，离心得到所述基因组DNA。根据本专利技术，所述样本来源于粪便、土壤、尿液或口腔细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为来源于粪便。根据本专利技术，步骤(1)所述样本与所述玻璃珠的质量比为1:(0.5-3)，例如可以是1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.3、1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.2、1:2.3、1:2.5、1:2.6、1:2.8或,1:3，优选为1:(0.8-2)。根据本专利技术，步骤(1)所述的酶液包括蜗牛酶、磷酸缓冲液和MgCl2。优选地，所述蜗牛酶的质量浓度为50-200mg/mL，例如可以是50mg/mL、52mg/mL、55mg/mL、56mg/mL、58mg/mL、60mg/mL、62mg/mL、65mg/mL、68mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、105mg/mL、110mg/mL、115mg/mL、120mg/mL、125mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL或200mg/mL，优选为80-120mg/mL。优选地，所述磷酸缓冲液的pH为6-8，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8，优选为6.8-7.4。优选地，所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为0.01-2M，例如可以是0.01M、0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.2M、1.5M、1.6M、1.8M或2M，优选为0.05-0.2M。优选地，所述MgCl2的摩尔浓度为0.1-2M，例如可以是0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.2M、1.3M、1.5M、1.6M、1.8M或2M，优选为0.2-0.5M。优选地，所述酶解的温度为40-70℃，例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、45℃、46℃、48℃、50℃、51℃、52℃、53℃、55℃、56℃、58℃、60℃、62℃、65℃、68℃或70℃，优选为45-65℃。优选地，所述酶解的时间为10-150min，例如可以是10min、12min、15min、20min、22min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min、90min、95min、100min、110min、120min、130min、140min或15本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括玻璃珠、蜗牛酶、裂解液和去除剂。

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括玻璃珠、蜗牛酶、裂解液和去除剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液中包括Tween-40；优选地，所述去除剂中包括CTAB和Al2(SO4)3；优选地，所述裂解液中还包括Tris-Cl缓冲液、EDTA或SDS中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述去除剂中还包括NaCl；优选地，所述试剂盒还包括CTAB；优选地，所述试剂盒还包括缓冲液、悬浮液、结合液、漂洗液或洗脱液中的任意一种或至少两种的组合。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括离心吸附柱；优选地，所述离心吸附柱的硅基质膜为美国产millpore硅基质膜。4.一种如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒用于真菌核酸的提取。5.一种真菌核酸的提取方法，其特征在于，采用如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，包括如下步骤：(1)将样本与玻璃珠涡旋混匀，加入酶液酶解；(2)向步骤(1)的混合液中加入裂解液混合，重悬；(3)将步骤(2)重悬后的样本加入去除剂混匀，离心；(4)将步骤(3)离心后的样本加入结合液混匀，加入吸附柱中，离心，漂洗，加入75％的无水乙醇，离心；(5)将步骤(4)离心后的样本加入洗脱液，离心得到所述基因组DNA。6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述样本来源于粪便、土壤、尿液或口腔细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为来源于粪便；优选地，步骤(1)所述样本与所述玻璃珠的质量比为1:(0.5-3)，优选为1:(0.8-2)；优选地，步骤(1)所述的酶液包括蜗牛酶、磷酸缓冲液和MgCl2；优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：穆延召，朱永亮，周燕，
申请(专利权)人：苏州普瑞森基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32