一种全菌胶囊及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种全菌胶囊及其制备方法和应用，所述制备方法包括以下步骤：(1)利用高通量测序筛选粪菌供体；(2)收集步骤(1)筛选的粪菌供体的粪便，制备粪菌液；(3)将步骤(2)制备的粪菌液和冻干保护剂混合后进行降温冷冻和真空干燥，得到的粪菌冻干粉装入胶囊壳内，得到所述全菌胶囊。本发明专利技术利用高通量测序对粪菌供体进行筛选，实现了快速筛选出针对不同的粪菌受体的粪菌供体，由此制备的全菌胶囊与粪菌受体精确匹配，药效显著。

【技术实现步骤摘要】
一种全菌胶囊及其制备方法和应用
本专利技术属于粪菌移植
，涉及一种全菌胶囊及其制备方法和应用。
技术介绍
菌群移植(FMT)是将健康人粪便中的功能菌群移植到患者肠道内，在患者肠道内建立新的肠道菌群，治疗肠道内和肠道外疾病的技术。近10年来，FMT在治疗肠道内和肠道外疾病方面取得了突破性进展，临床上对FMT治疗肠道内外疑难疾病寄予厚望。但是，由于FMT方法学的建立较为复杂，国内外尚无统一的标准，导致了各类研究疗效的异质性较大，极大地限制了FMT的临床推广应用。目前，粪菌移植在治疗难辨性梭状芽孢杆菌感染、肠易激综合征、炎症性肠病等肠道菌群失调引起的疾病方面具有良好的效果。临床上主要通过灌肠、鼻胃管、十二指肠、空肠和结肠镜等途径进行菌群移植，但是这些途径都涉及侵入性移植，患者体验差。CN209967402U公开了一种经胃肠镜粪菌移植推注导管，包括中空设置的手柄及用于推注粪菌的导管，手柄的一端设置有用于连接导管的连接部，手柄远离导管的一侧设置有用于注射粪菌的注射管。使用该导管进行粪菌移植，可以使整个推注过程在可视化条件下进行，并能避免粪菌对检查仪器造成污染，加强了粪菌移植内镜下操作的规范化。然而该装置需要与灌肠处理配合使用，对体质较弱或肠道有糜烂损伤的患者容易造成二次伤害。CN110638783A公开了一种胶囊的制备方法，利用粪菌移植供体的健康优质粪便在体外模拟肠道微生物对党参皂苷的酶解作用，通过适当的发酵条件，将党参皂苷降解转化为次级皂甙类活性小分子物质，继而发挥药效。将含有活性小分子物质的粪菌发酵液装入肠溶性胶囊壳，给患者使用，在改善肠道菌群的同时，能使患者更好地吸收活性物质，有益健康。然而，该方案未对有益菌进行保存等操作，容易失活，需在短时间内尽快使用，不宜长期保存。CN109010380A公开了一种粪菌移植临床治疗中的肠道菌群制剂的工艺，包括粪便采集、肠道菌群制剂制备和肠道菌群制剂灌装三个步骤，其中肠道菌群制剂制备采用了“有氧+厌氧”的新型的分离方法，最大程度地保护肠道内“需氧菌”和“厌氧菌”的菌群多样性，并加入甘油保护剂来维持细菌的活性。然而，该工艺在操作时需要将一定体积的悬浊液与甘油溶液混合，制成的肠道菌群制剂中菌群浓度低，药效低。目前，粪菌移植主要通过机械介入的方法，过程复杂，患者有一定的痛苦。如何提供一种快速、高效的FMT新技术，不仅能够减轻患者的痛苦，还能够提供数量充足的有益菌用于疾病治疗或症状改善，已成为亟待解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种全菌胶囊及其制备方法和应用，所述全菌胶囊中装有经高通量测序筛选的粪菌供体的菌群冻干粉，提高了菌群移植的有效率和舒适度，在临床上具有广泛的应用前景。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种全菌胶囊的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)利用高通量测序筛选粪菌供体；(2)收集步骤(1)筛选的粪菌供体的粪便，制备粪菌液；(3)将步骤(2)制备的粪菌液和冻干保护剂混合后进行降温冷冻和真空干燥，得到的粪菌冻干粉装入胶囊壳内，得到所述全菌胶囊。本专利技术中，利用高通量测序对粪菌供体进行筛选，有利于准确鉴别粪菌供体的菌群组成，在发现粪菌供体的未知物种、病原体方面具有优势，检测分辨率达到菌株水平，实现了一次检测多个粪菌供体的效果。优选地，步骤(1)所述利用高通量测序筛选粪菌供体的方法包括以下步骤：(1’)将提取自粪菌供体的DNA和/或RNA进行二代测序，获得原始测序数据；(2’)去除原始测序数据的宿主基因后，与微生物数据库进行比对，进行菌种鉴定和丰度检测；(3’)与致病菌数据库进行比对，确认粪菌供体中无致病菌；(4’)与粪菌受体的肠道菌群进行比较，筛选得到与粪菌受体互补的粪菌供体。本专利技术中，采用高通量测序鉴定粪菌供体的粪菌组成，并与粪菌受体(患者)的肠道菌群进行比较，有利于针对不同的粪菌受体筛选不同的粪菌供体，实现“精准匹配”，提高药效；高通量测序还能鉴定出致病菌，有利于排除有潜在风险的粪菌供体，进行质量监控。优选地，步骤(2’)所述微生物数据库包括来源于公共数据库的细菌基因组、真菌基因组或病毒基因组中的任意一种或至少两种的组合。优选地，步骤(3’)所述致病菌数据库包括来源于公共数据库的致病菌基因组。本专利技术中，利用NCBI、KEGG等公共数据库构建微生物数据库和致病菌数据库，将粪菌供体的测序数据比对到上述数据库中，实现菌株水平的微生物鉴定，排除了携带致病菌的粪菌供体，减少了健康风险。优选地，步骤(1)所述利用高通量测序筛选粪菌供体根据粪菌供体表达的生物标志物和所述生物标志物的多样性指数。优选地，所述生物标志物包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、多支梭菌(Clostridiumramosum)、柱状真杆菌(Eubacteriumcylindroides)、人罗斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)、普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)或普通拟杆菌(Bacteroidesvulgatus)中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述生物标志物的多样性指数包括所述生物标志物的α多样性指数。本专利技术中，利用高通量测序结合机器学习模型，筛选出生物标志物大肠杆菌(Escherichiacoli)、多支梭菌(Clostridiumramosum)、柱状真杆菌(Eubacteriumcylindroides)、人罗斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)、普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)和普通拟杆菌(Bacteroidesvulgatus)，以及生物标志物的α多样性指数，作为筛选粪菌供体的指标。优选地，步骤(2)所述粪菌液的制备方法包括以下步骤：(1”)将收集的粪便浸泡于无菌生理盐水中，过滤后得到粪便滤液；(2”)将粪便滤液离心处理，取沉淀与无菌生理盐水混合，得到所述粪菌液。本专利技术中，粪菌供体的粪便使用无菌容器在现场收集，收集的粪便1h内送至实验室进行信息登记、粪便鉴定、称重、评估和处理，粪便捐献6h内，在厌氧环境中完成粪菌液的制备。优选地，步骤(1”)所述无菌生理盐水的温度为3～5℃，例如可以是3℃、4℃或5℃。优选地，步骤(1”)所述过滤采用滤网进行。优选地，所述滤网的孔径为0.25～2mm，例如可以是0.25mm、0.5mm、1.0mm或2.0mm。优选地，步骤(1”)所述过滤包括依次使用2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的滤网去除大颗粒物，随后使用0.25mm的滤网过滤2～3次，得到的液相为粪便滤液。优选地，步骤(2”)所述离心处理的转速为1500～3000r/min，例如可以是150本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种全菌胶囊的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：/n(1)利用高通量测序筛选粪菌供体；/n(2)收集步骤(1)筛选的粪菌供体的粪便，制备粪菌液；/n(3)将步骤(2)制备的粪菌液和冻干保护剂混合后进行降温冷冻和真空干燥，得到的粪菌冻干粉装入胶囊壳内，得到所述全菌胶囊。/n

【技术特征摘要】
1.一种全菌胶囊的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)利用高通量测序筛选粪菌供体；
(2)收集步骤(1)筛选的粪菌供体的粪便，制备粪菌液；
(3)将步骤(2)制备的粪菌液和冻干保护剂混合后进行降温冷冻和真空干燥，得到的粪菌冻干粉装入胶囊壳内，得到所述全菌胶囊。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述利用高通量测序筛选粪菌供体的方法包括以下步骤：
(1’)将提取自粪菌供体的DNA和/或RNA进行二代测序，获得原始测序数据；
(2’)去除原始测序数据的宿主基因后，与微生物数据库进行比对，进行菌种鉴定和丰度检测；
(3’)与致病菌数据库进行比对，确认粪菌供体中无致病菌；
(4’)与粪菌受体的肠道菌群进行比较，筛选得到与粪菌受体互补的粪菌供体。


3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2’)所述微生物数据库包括来源于公共数据库的细菌基因组、真菌基因组或病毒基因组中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(3’)所述致病菌数据库包括来源于公共数据库的致病菌基因组。


4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述利用高通量测序筛选粪菌供体根据粪菌供体表达的生物标志物和所述生物标志物的多样性指数；
优选地，所述生物标志物包括大肠杆菌、多支梭菌、柱状真杆菌、人罗斯拜瑞氏菌、普拉梭菌、脆弱拟杆菌或普通拟杆菌中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述生物标志物的多样性指数包括所述生物标志物的α多样性指数。


5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述粪菌液的制备方法包括以下步骤：
(1”)将收集的粪便浸泡于无菌生理盐水中，过滤后得到粪便滤液；
(2”)将粪便滤液离心处理，取沉淀与无菌生理盐水混合，得到所述粪菌液；
优选地，步骤(1”)所述无菌生理盐水的温度为3～5℃；
优选地，步骤(1”)所述过滤采用滤网进行；
优选地，所述滤网的孔径为0.25～2mm；
优选地，步骤(1”)所述过滤包括依次使用2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的滤网去除大颗粒物，随后使用0.25mm的滤网过滤2～3次，得到的液相为粪便滤液；
优选地，步骤(2”)所述离心处理的转速为1500～3000r/min；
优选地，步骤(2”)所述离心处理的时间为10～20min。


6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述冻干保护剂包括脱脂乳粉、海藻糖、蔗糖、维生素C和无菌生理盐水；
优选地，所述冻干保护剂按质量百分比包括：脱脂乳粉10％～20％、海藻糖10％～15％、蔗糖1％～10％、维生素C1％～5％，余量为生理盐水；
优选地，步骤(3)所述粪菌液和所述冻干保护剂的体积比为(2～5):1；
优选地，步骤(3)所述降温冷冻的条件为10～20s由室温降至3～6℃，1～2℃/min由3～6℃降至-30～-50℃，4～5℃/min由-30～-50℃降至-75～-80℃；
优选地，步骤(3)所述降温冷冻的时间为12～24h；
优选地，步骤(3)所述真空干燥的真空度为5～15pa；
优选地，步骤(3)所述真空干燥的温度为-50～-60℃；
优选地，步骤(3)所述真空干燥的时间为24～48h；
优选地，步骤(3)所述胶囊壳包括肠溶胶囊壳；
优选地，所述全菌胶囊保存于-75...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆敏，张宝钰，刘丹，张水龙，王一伟，朱永亮，朱蒙蒙，
申请(专利权)人：苏州普瑞森基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32