环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用及抑菌剂制造技术

本发明专利技术涉及棉花防病领域，具体涉及环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用及抑菌剂。本发明专利技术利用CGTase实现了对病原菌的抑制及对棉花防御相关基因的诱导，不仅提供了CGTase的用途，也为植物病害的防治提供了新的拮抗物质。CGTase作为一种蛋白质，其不会造成环境污染和残留的特点，使其具有应用的潜力。

Application of cyclodextrin glucosyl transferase to cotton Verticillium Wilt and its bacteriostatic agent

The invention relates to the field of cotton disease prevention, in particular to the application of cyclodextrin glucosyl transferase to the inhibition of Verticillium dahliae and bacteriostatic agent. The invention uses CGTase to inhibit the pathogen and induce the gene of cotton defense. It not only provides the use of CGTase, but also provides a new antagonist for the control of plant diseases. As a protein, CGTase does not cause environmental pollution and residue characteristics, so it has the potential of application.

【技术实现步骤摘要】
环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用及抑菌剂
本专利技术涉及棉花防病领域，具体涉及环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用及抑菌剂。
技术介绍
棉花(Gossypiumhirsutum)是全球重要的经济作物，棉花黄萎病(Verticilliumwilt)是棉花毁灭性损失重要胁迫因子之一。生产上化学农药是相对稳定可靠的作物保护方法，然而施用化学农药导致病原物抗药性增强，微生态环境破坏。化学防治对环境污染严重且对土传病害防治效果不佳，生物防治符合绿色、安全的现代农业发展需求，成为防治棉花黄萎病的重要途径。环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)是一种重要的工业用酶，能够将淀粉转移糖基形成环糊精，目前还未见CGTase作为抑菌物质的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用。本专利技术的再一目的是提供棉花黄萎病菌抑菌剂。根据本专利技术的具体实施方式，所述环糊精葡萄糖基转移酶来自蜡状芽孢杆菌YUPP-10。根据本专利技术的具体实施方式，所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，该酶包括718个氨基酸，其第8-32氨基酸区域有一个跨膜结构区，第1-23氨基酸为信号肽序列，局部亲水良好。SEQIDNo.1：MFQMAKRVLLSTTLTFSLLAGSALPFLPASAIYADADTAVTNKQNFSTDVIYQVFTDRFLDGNPSNNPTGAAFDGTCSNLKLYCGGDWQGLINKINDNYFSDLGVTALWISQPVENIFATINYSGVTNTAYHGYWARDFKKTNPYFGTMTDFQNLVTTAHAKGIKIIIDFAPNHTSPAMETDTSFAENGKLYDNGSLVGGYTNDTNGYFHHNGGSDFSTLENGIYKNLYDLADLNHNNSTIDTYFKDAIKLWLDMGVDGIRVDAVKHMPQGWQKNWMSSIYAHKPVFTFGEWFLGSAASDADNTDFANESGMSLLDFRFNSAVRNVFRDNTSNMYALDSMLTATAADYNQVNDQVTFIDNHDMDRFKTSAVNNRRLEQALAFTLTSRGVPAIYYGTEQYLTGNGDPDNRGKMPSFSKSTTAFNVISKLAPLRKSNPAIAYGSTQQRWINNDVYIYERKFGKSVAVVAVNRNLTTPTSITNLNTSLPSGTYTDVLGGVLNGNNITSSGGNISSFTLAAGATAVWQYTASETTPTIGHVGPVMGKPGNVVTIDGRGFGSAKGTVYFGTTAVTGSAITSWEDTQIKVTIPPVAGGDYAVKVAANGVNSNAYNDFTILSGDQVSVRFVINNATTALGENIYLTGNVSELGNWTTGAASIGPAFNQVIHAYPTWYYDVSVPAGKQLEFKFFKKNGATITWEGGSNHTFTTPTSGTATVTVNWQ根据本专利技术的具体实施方式，从蜡状芽孢杆菌YUPP-10中筛选到抑菌物质环糊精葡萄糖基转移酶，其能抑制棉花黄萎病病原菌。本专利技术提供了环糊精葡萄糖基转移酶在诱导棉花防御相关基因表达方面的应用。本专利技术的有益效果是：(1)环糊精葡萄糖基转移酶由棉花内生细菌蜡状芽孢杆菌YUPP-10产生，作为植物内生细菌产生的胞外酶，其对寄主无破坏、对环境无污染，是一种安全的蛋白质。本专利技术首次将该种类酶用于植物病害的防治和诱导植物防御基因的激发。(2)环糊精葡萄糖基转移酶对分生孢子产孢量的抑制率最高达58.44％，对孢子萌发的抑制率最高达63.58％，对微菌核萌发的抑制率最高达28.35％，均达到了较好的抑制效果。(3)使用环糊精葡萄糖基转移酶蛋白液注射棉花叶片，注射后不同时间点检测防御相关基因的表达，其能激活过敏反应的标志基因，并能诱导苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和水杨酸信号通路的标志基因病程相关基因1(PR1)的表达。附图说明图1显示环糊精葡萄糖基转移酶处理后棉花防御相关基因PAL的表达。图2显示环糊精葡萄糖基转移酶处理后棉花防御相关基因POD的表达。图3显示环糊精葡萄糖基转移酶处理后棉花过敏反应标志基因HSR203J的表达。图4显示环糊精葡萄糖基转移酶处理后棉花防御相关基因PR1的表达。具体实施方式实施例1环糊精葡萄糖基转移酶对大丽轮枝菌的抑制作用一、环糊精葡萄糖基转移酶对大丽轮枝菌孢子萌发的影响1、环糊精葡萄糖基转移酶的分离纯化将去除信号肽的片段连接亲水标签，通过PCR在CGTase基因N端连接His6标签和Sumo标签，再插入到pET41a的NdeI/NotI位点中，得到重组质粒，通过热击转化，成功将pET41a-CGTase转入大肠杆菌BL21。将成功转化的菌株BL21接种到LB液体培养基中，37℃振荡培养，生长至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.00和1.25mM的IPTG在低温16℃，250r/min培养18h诱导目标蛋白的表达；取生长至OD600为0.6-0.8时，加入1mM的IPTG在16、17、18、19和20℃的低温下250r/min振荡培养18h诱导目标蛋白的表达。离心收集菌体，弃上清，使用平衡缓冲液重悬菌体(10mL/g)，用超声波破碎仪处理，然后吸取50mL至新管为全菌样品；将超声处理的样品高速离心，上清移至新管为上清样品，沉淀使用缓冲液重悬为沉淀样品。SDS-PAGE检测各种样品中目的蛋白表达情况。在试验所选择的IPTG浓度中，1mM的IPTG终浓度表达量最高；在加入1mM的IPTG诱导剂浓度后，分别在5个不同的低温诱导下，18℃的表达量最高，因此选择CGTase表达培养的最佳IPTG浓度为1mM，温度为18℃。将成功转化的菌株BL21接种到LB液体培养基中，37℃振荡培养，生长至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，18℃，250r/min振荡培养18h，收集菌体，制备上清样品，SDS-PAGE检测蛋白表达。上清过滤后，使用AKTA系统进行蛋白纯化。2、测定环糊精葡萄糖基转移酶对大丽轮枝菌孢子萌发的影响、及对大丽轮枝菌分生孢子产孢量的影响利用悬滴法测定环糊精葡萄糖基转移酶对大丽轮枝菌孢子萌发的影响。在Czapek培养基中接种PDA平板上已经活化的直径为5mm的Vd080菌饼，在25℃，180r/min的恒温振荡培养箱中培养7d后，用4层医用无菌纱布过滤，滤液即为Vd080孢子悬浮液，利用血球计数板查看孢子浓度。取浓度分别为0.24、0.48、和0.96mg/mL的环糊精葡萄糖基转移酶溶液500μL，与等体积的大丽轮枝菌孢子悬浮液(2×103cfu/mL，Czapek培养液)混合，取20μL悬滴于载玻片上，在25℃下保湿培养，3h后镜检孢子萌发情况，以蛋白缓冲液与Vd080孢子悬浮液的等体积混合液为对照，镜检检测其萌发率，每处理重复3次，每次观察100个微菌核的萌发情况。微菌核长出的芽管长度超过微菌核直径的一半视为萌发。用不同浓度的环糊精葡萄糖基转移酶处理后，对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制率、对微菌核萌发的抑制率和产孢量的抑制率分别在23.94-6本文档来自技高网...

【技术保护点】
环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用。

【技术特征摘要】
1.环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用。2.根据权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶来自蜡状芽孢杆菌YUPP-10。3.根据权利要求2所述的环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQIDNo...

【专利技术属性】
技术研发人员：周京龙，朱荷琴，周燚，冯自力，冯鸿杰，魏锋，师勇强，赵丽红，袁媛，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，长江大学，
类型：发明
国别省市：河南,41