一种快速检测奶粉中肠杆菌科的方法技术

本发明专利技术提供一种奶粉中肠杆菌科的快速定性检测方法，所述方法对样品进行前增菌，提高Soleris仪器检测的准确率。

A method for rapid detection of Enterobacteriaceae in milk powder

The invention provides a fast qualitative detection method for Enterobacteriaceae in milk powder. The method pre enriching samples and improves the accuracy of Soleris instrument detection.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测奶粉中肠杆菌科的方法
本专利技术提供一种奶粉中肠杆菌科的快速定性检测方法，所述方法对样品进行前增菌，提高Soleris仪器检测的准确率。专利技术背景随着科技的发展和人们生活水平的不断提高，食品安全日益受到人民的关注。食源性疾病是导致食品安全问题的主要原因之一，而食品微生物污染则是引起食源性疾病的根源，因此微生物检测技术的革新对于控制食源性疾病具有重要意义。肠杆菌科检测项目是欧盟等国家要求的检测项目，我国出口产品在出入境机构也进行这项检测。我国食品中肠杆菌科检验方法GB4789.41-2016,检测时间为3天至4天，前处理时间为42-46h。Soleris微生物实时光电快速检测系统(以下简称Soleris法)是基于传统的培养基理论和染色技术准确检测微生物常规指标的新技术，能够有效缩短检测时间、提高检测效率，提前预警。Soleris法是在预制的Soleris试剂瓶中放置特异性的培养基和专用指示剂,当微生物在培养瓶中生长时,会发生代谢产物改变培养基pH值或释放CO2等生化反应,从而引起指示剂的颜色变化。实践中，Soleris法在检测奶粉或其他食品类样品中的肠杆菌科时，常由于取样量少代表性不足，会出现漏检现象。本专利技术基于soleris仪器法，开发了一种与soleris仪器法相配套的前增菌方法。本专利技术利用前增菌方法与soleris仪器法联合检测奶粉中的肠杆菌，检测时间短，漏检率低，整体检测时间由国标方法的4天缩短至24-25小时。
技术实现思路
本专利技术具体涉及以下方面的内容：一种快速检测奶粉中肠杆菌科的方法，其包括步骤(1)前增菌步骤；和(2)Soleris仪器检测。所述方法中，步骤(1)前增菌步骤所使用的前增菌培养是在基础培养基的基础上进行优化后的培养基，其中所述的基础培养基为：蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠9.0g，磷酸二氢钾1.5g，蒸馏水1000mL，pH7.2±0.2。所述方法中，优化培养基使用的碳源为葡萄糖，优选地其添加浓度为0.5-1％，更优选为0.5％，其中的百分比浓度为该组分在培养基中的质量体积百分比浓度。所述方法中，优化培养基的氮源为复合氮源；优选为酵母粉和胰蛋白胨的复合氮源；更优选地，酵母粉和胰蛋白胨的质量比为1：2。所述方法中，优化培养基中的无机盐为KH2PO4合K2HPO4，优选地KH2PO4：K2HPO4的质量比为1：6。所述方法中，优化培养基中含有牛胆盐，优选地，牛胆盐添加浓度为0.15％，，其中的白分比浓度为该组分在培养基中的质量体积百分比浓度。前述方法，其中步骤(1)中所使用的优化培养基为葡萄糖0.5-1％，胰蛋白胨0.5-1％，酵母粉0.5-1％，牛胆盐0.1-0.18％，磷酸氢二钾0.60％，磷酸二氢钾0.15％；优选地，为胰蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，葡萄糖0.5％，牛胆盐0.15％，磷酸氢二钾0.60％，磷酸二氢钾0.15％，其中所述的百分比浓度为各个组分在培养基中的质量体积百分比浓度。前述方法，其中前增菌时间为4-8h，优选为4-5h。本专利技术所取得的技术效果：前增菌法与soleris法联合检测，可将奶粉中肠杆菌科的检测时间缩短，由标准方法的3-4天缩短至24-25小时。与常规的soleris检测方法比较，避免了常规Soleris检测方法的假阴性情况。本专利技术的前增菌方法与soleris法联合进行奶粉中肠杆菌科的检测，具有很高的敏感度。本专利技术的前增菌方法与soleris法联合检测方法特异性较强，不受外来成分、包括其它杂菌的干扰。该方法特异性优于国标方法。并且本专利技术所述方法不会出现假阳性的现象。此外，本专利技术方法操作简便，可减少检测过程中的污染，减少人力物力，提高工作效率。实施例1国标法：肠杆菌科MPN计数法检测1.试样制备以无菌操作，将检样25g溶于含有225mL的纯净水中，充分振摇瓶子混合均匀，做成1:10的均匀稀释液。用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释培养液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mLEE肉汤的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。2.非选择性前增菌选用适宜的三个连续稀释的样液，从每个样液中分别吸取1mL，一式三份的接种于3管装有TSB的试管中，于36℃±1℃培养18-24h。3.选择性增菌分别转种1mL非选择性增菌培养物于9管装有MEE肉汤中，于36℃±1℃培养18-24h。4.分离分别从培养的9管培养液中取一环划线于VRBGA平板表面，于36℃±1℃培养18-24h。5.挑选菌落和确认从每个培养过的呈现粉红-红色(有或无沉淀环)或无色，粘液状菌落的平板上随机挑选至少两个典型或可疑菌落进行确认。5.1葡萄糖发酵试验用接种环挑取可疑菌落在葡萄糖琼脂斜面上划线并穿刺，并置于36±1℃培养箱内培养24±2h，取出后观察颜色变化。若试管内的整个内容物都变为黄色或黄底层，蓝斜面，视为阳性反应，大多数菌株产气。5.2氧化酶试验用接种环或接种针从营养琼脂平板上挑取与葡萄糖发酵试验同一菌落，涂于湿润的氧化酶试纸上，或将一滴氧化酶试剂直接滴加于选择的菌落上，滤纸或平板上菌落的颜色在10s内不变成蓝紫色，该试验视为阴性。实施例2仪器法(前增菌法与soleris法联合检测)方法和步骤1.以无菌操作，将待检样品10g溶于含有90mL前增菌培养基中，充分振摇三角瓶子混合均匀，制成1:10的均匀稀释液。2.将装有样品和培养基的瓶子放于36±1℃培养箱内培养4-5h。3.用移液管吸取5mL上述培养液，于肠杆菌科检测试剂瓶中，用soleris仪器进行检测，35℃±1℃，培养18h。4.为了验证Soleris仪器检测的正确性，同时对前增菌步骤获得培养基进行划线培养，确认菌落形态、挑选菌落进行革兰氏染色确认、葡萄糖发酵试验、以及氧化酶等试验以验证仪器法的检测结果。前增菌培养基的筛选与获得1材料与方法1.1材料与仪器菌种：阪崎肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、柠檬酸杆菌(乳制品产品中较多的肠杆菌科的菌种)、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽胞杆菌。样品：奶粉样品(未检出肠杆菌科)基础培养基：蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠9.0g，磷酸二氢钾1.5g，蒸馏水1000mL，pH7.2±0.2，高压灭菌121℃，15min。前增菌培养基的优化试验是在该基础培养基的基础上进行试验。仪器：恒温培养箱、超净工作台、高压灭菌器、pH试纸、soleris仪器。1.2实验方法1.2.1培养基试验标准菌株阪崎肠杆菌、沙门氏菌、柠檬酸杆菌和志贺氏菌分别在37℃下恒温条件下活化培养24h，再进行梯度稀释，以5CFU/瓶左右的量接种到装有90mL的液体基础培养基、加入到10g奶粉样品(已灭菌)的三角瓶中，37℃增菌培养4-18h。1.2.2检测增菌液中菌含量在不同成分的培养基中分别接种一定量的目标菌，以5CFU/瓶左右的量接种到装有90mL的液体基础培养基中，37℃培养18h。分别选取培养0h、4h、6h、10h、18h的培养液，用可见分光光度计测定600nm波长处的OD值。1.2.3非目标菌在此培养基中的生长在制备的培养基中分别按照5CFU/瓶的接种量接种沙门氏菌、柠檬酸杆菌和志贺氏菌3种目标菌及金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测奶粉中肠杆菌科的方法，其包括步骤(1)前增菌步骤；和(2)Soleris仪器检测。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测奶粉中肠杆菌科的方法，其包括步骤(1)前增菌步骤；和(2)Soleris仪器检测。2.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)前增菌步骤所使用的前增菌培养是在基础培养基的基础上进行优化后的培养基，其中所述的基础培养基为：蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠9.0g，磷酸二氢钾1.5g，蒸馏水1000mL，pH7.2±0.2。3.权利要求2所述的方法，其中所述优化培养基的碳源为葡萄糖，优选地，葡萄糖添加浓度为0.5-1％，更优选为0.5％。4.权利要求3所述的方法，其中所述优化培养基的氮源为复合氮源；优选为酵母粉和胰蛋白胨的复合氮源；更优选地，酵母粉和胰蛋白胨的质量比为1：2。5.权利要求4所述的方法，其中所述优化培养基中的无机盐为KH2PO4和K2HPO4，优选地KH2PO4：K2HPO4的质量比例为1：6。6.权利要求5所述的方法，其中所述优化培养基中含有牛胆盐，优选地，牛胆盐添加浓度为0.15％。7.权利要求2-6中任一项所述的方法，其中步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁春梅，吴玉秋，李秋琴，喻东威，宋晓东，薛志清，解鑫，许璐，赵媛，高永亮，常建军，
申请(专利权)人：内蒙古蒙牛乳业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15