一种制备阿维菌素的方法及其专用菌株技术

本发明专利技术公开了一种制备阿维菌素的方法及其专用菌株。本发明专利技术菌株为阿维链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＺＬＸ６００１，保藏编号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２７１２。本发明专利技术的制备阿维菌素的方法，是发酵阿维链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＺＬＸ６００１，得到阿维菌素。实验证明，本发明专利技术的菌株生产阿维菌素有效组分Ｂ１ａ的能力强，可达６０００μｇ／ｍｌ发酵液，而且本发明专利技术菌株连续传５代后其生产阿维菌素有效组分Ｂ１ａ的能力还保持原来水平，表明其遗传稳定性好。用本发明专利技术菌株来制备阿维菌素的方法，能够提高生产阿维菌素的效率，而且方法简单、成本低廉。因此，本发明专利技术菌株及制备阿维菌素的方法适合于在阿维菌素的生产中推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备阿维菌素的方法及其专用菌株。
技术介绍
阿维菌素是一种大环内酯类抗生素，具有广谱的抗线虫和肠道寄生虫的性质， 是目前世界上最有前景的生物杀虫杀螨剂。阿维菌素的杀虫作用是通过释放神经传 导抑制剂、使害虫缓慢麻痹致死来实现的，对宿主的副作用较低，在环境中无累积， 对人、畜均具有安全性，所以阿维菌素在动物保健和农业生产方面有广泛的应用， 具有广阔的市场发展前景。阿维菌素是由除虫链霉菌(^Yre/^oy^ces 3^r肌Y^^s) 生产的一组由十六元大环内酯与一个二糖(齐墩果糖)所构成的一类杀虫抗生素，共 有4对8个同系物，即阿维菌素Ala / Alb 、 Bla / Bib 、 A2a /A2b 、 B2a / B2b 。 在这8个化合物中，以阿维菌素Bla活性最高。1999年，阿维菌素成为世界第21 大畅销农药，第4大畅销杀虫剂，销售额高达1.6亿美元。以阿维菌素为母体，还 可以开发出一系列活性更高、选择性更强、使用更加安全的衍生新品种，己商品化 的品种包括伊维菌素、埃玛菌素、道拉菌素、埃珀利诺菌素和色拉菌素等。其中的 伊维菌素是目前世界上销售量最大的兽药，1981年的年销售额就达到了 10亿美元， 创单项兽药销售收入最高;埃珀利诺菌素则被美国FDA认定为全程安全畜用驱虫剂。 此外，近年来又有研究发现阿维菌素有抗肿瘤的功效，并且对肿瘤细胞的抗药性也 有一定的抑制作用。阿维菌素具有不易产生抗药性、易降解和无残留的特点，使其 成为高毒农药的最佳替代品。基于以上优点，阿维菌素在各个国家的需求不断上升。 因此，需要提高阿维菌素的生产效率，以供应日益增长的需求。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一株阿维链霉菌，该菌株能高产阿维菌素。 本专利技术所提供的阿维链霉菌菌株为阿维链霉菌(5^re;^o/^ces 3^/77 i'^7A) ZLX6001，保藏编号为CGMCC No. 2712。阿维链霉菌菌株ZLX6001是好氧的革兰氏阳性嗜温放线菌，形成分枝状基生菌 丝和长的紧密螺旋的气生菌丝。孢子链由15个或以上的表面光滑的圆形或卵形孢 子构成。在燕麦培养基上形成灰色的气生孢子团，菌落背面黑褐色。在蛋白胨酵母提取物和铁培养基上产生黑色素。该菌株已于2008年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所， 邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 2712。本专利技术的另一个目的是提供一种制备阿维菌素的方法。本专利技术所提供的制备阿维菌素的方法，是发酵阿维链霉菌(5Yr印fo/^c" ave27zu'"h^) ZLX6001，得到阿维菌素。所述发酵的方法是将所述菌株接种于发酵培养基中，在温度为25-3(TC的条件 下培养。其中，所述发酵培养基由终浓度为105-195g/L的玉米淀粉、终浓度为20-36g/L 的豆粕粉、终浓度为6-12g/L的酵母粉、终浓度为0. 175-0. 325g/L的(NH4) 2S04、 终浓度为0. 014-0. 026g/L的CoCl2、终浓度为0. 015-0. 028g/L的Na2Mo04、终浓度 为0. 0016-0. 003g/L的MnS04、终浓度为2800-5200 U/L的淀粉酶和终浓度为 0.6-1.0g/L的CaC03组成，余量为水；所述终浓度均为在所述发酵培养基中的浓度。所述发酵培养基优选为如下培养基由终浓度为150g/L的玉米淀粉、终浓度 为28g/L的豆粕粉、终浓度为9g/L的酵母粉、终浓度为0.25g/L的(NH4) 2S(^、终 浓度为0. 02g/L的CoCl2、终浓度为0. 022g/L的Na2Mo04、终浓度为0. 0023g/L的 MnS(X终浓度为4000 U/L的淀粉酶和终浓度为0. 8g/L的CaCO.,组成。所述发酵可以在振荡的条件下进行，所述振荡的转速可以为200-250rpm，旋转 半径为50ram。所述振荡的转速优选为220rpm。为了防止发酵液因过多蒸发而浓縮，造成虚假的发酵单位，保持发酵过程中环 境相对湿度为50-60%。所述发酵的温度优选为28°C。所述发酵的时间可为192-240小时，优选为240小时。实验证明，本专利技术的菌株生产阿维菌素有效组分Bla的能力強，可达6000u g/ml发酵液，而且本专利技术菌株连续传5代后其生产阿维菌素有效组分Bla的能力还 保持原来水平，表明其遗传稳定性好。用本专利技术菌株来制备阿维菌素的方法，能够 提高生产阿维菌素的效率，而且方法简单、成本低廉。因此，本专利技术菌株及制备阿 维菌素的方法适合于在阿维菌素的生产中推广应用。 附图说明图1为阿维菌素有效组分Bla标准品色谱图。 图2为发酵滤液中阿维菌素有效组分Bla色谱图。 具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 实施例l、菌株的制备 一、菌株的制备本实验中用到的高通量初筛方法如下发酵阶段采用96孔深孔板，每孔中装培养基0.3 ml。每孔接入菌种，28°C 静置培养10天。所用培养基由终浓度为150g/L的玉米淀粉、终浓度为28g/L的豆 粕粉、终浓度为9g/L的酵母粉、终浓度为0.25g/L的(NH4)2S04、终浓度为2g/L的 CoCl2、终浓度为0. 022g/L的Na2Mo04、终浓度为0. 0023g/L的MnS04、终浓度为4000 U/L的淀粉酶、终浓度为0. 8g/L的CaC03、和终浓度为20g/L的琼脂组成。提取阶段将每孔用1 ml甲醇浸泡，捣碎，取上清。测定阶段用酶标仪测定上清在245nm下的UV吸收值。菌株的制备过程如下1、 从土壤中分离菌株 .取河北省的土壤，将土壤制成悬浮液，将土壤悬浮液接种于分离培养基中进行 培养，挑取单菌落进行稀释划线分离纯化，获得纯培养菌株；分离培养基由终浓度 为20g/L的葡萄糖(单独灭菌后加入)，终浓度为20g/L的琼脂，终浓度为2g/L 的酵母膏，终浓度为0.5g/L的天门冬素及终浓度为0.5g/L的K2HP04组成，余量为 水；pH 7.2-7.4; 115度，灭菌20分钟；初筛获得的纯培养菌株进行摇瓶发酵培养，发酵液经8000rpm离心5分钟， 上清液经0. 45^的微孔滤膜过滤获得发酵滤液；HPLC分析法检测发酵液中是否含 有阿维菌素；将能产生阿维菌素有效组分Bla的菌株分别进行如下系列菌种改造。2、 菌种改造(1)紫外线复合链霉素诱变 取菌悬液7ml，加入无菌培养皿中，以30W的紫外照射仪于30cm处照射。设 定照射时间分别为60s、 90s。分离培养基灭菌后，加入终浓度O. lug/ml、 0. 2 u g/ml经过滤除菌的链霉素，铺制平皿，经紫外线处理后的菌悬液稀释涂布于平皿中， 28i:培养10d。挑取单菌落按照上述方法进行高通量筛选、摇瓶复试。获得的高产菌株进行下一步诱变。(2) 紫外线复合链霉素诱变(第2轮) 对第一轮紫外线复合链霉素诱变获得的高产菌株用同样的方法再次进行紫外线复合链霉素诱变。28'C培养10d。挑取单菌落进行高通量初筛、摇瓶复试。获得 的高产菌株进行下一步诱变。(3) 5-氟尿嘧啶诱变 将菌株斜面接种于无有机氮源的饥饿培养基中本文档来自技高网...

【技术保护点】
阿维链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＺＬＸ６００１，保藏编号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２７１２。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张立新，刘梅，高弘，周贤龙，徐兵，刘金涛，卓英，陈涤非，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]