一种生产寡霉素A的方法及其专用菌株技术

本发明专利技术提供一种生产寡霉素Ａ的方法及其专用菌株，该方法包括如下步骤：１）菌株培养：将产寡霉素Ａ的菌株阿维链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）Ｌ０３３　ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２６７８发酵培养得到菌丝体；２）用有机溶剂浸提菌丝体得到寡霉素Ａ；该菌株为阿维链霉菌（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）Ｌ０３３　ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２６７８。本发明专利技术的菌株可产生丰富的孢子，生长速度快，便于工业化生产；本发明专利技术的菌株生产寡霉素Ａ的产率较高，产量可达１４６１μｇ／ｍｌ发酵液。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及寡霉素的生产方法及其生产菌株，特别是涉及一种生5产寡霉素A的方法及其专用菌株。
技术介绍
寡霉素具有多种生物学活性，例如具有强烈的抗真菌活性、抗肿 瘤活性和呼吸抑制作用。寡霉素ABC混合物可强烈抑制黑曲霉(J^wg/〃w m'gw),多孔木 10霉 (7b/_y/ oc/a<i/MW /"y/o^/w ), Fwsan'ww ocw^/ orM柳，新月弯孢菌 (CMrvw/an'a/"""to)和7Hc/zocfe環a a/6a, 尤其对人类致病菌皮炎芽 生菌(祝"Wowjc&y derma故Ws)具有显著的抑制活性(Smith d a/., 1954;Gmmmatikova^a/.,2003 )。 一般地，寡霉素A、 B和C的抗真 菌活性强度为A > B > C ( Marty and McCoy, 1959 )。寡霉素A对植物 15致病菌灰葡萄孢菌(), 黄瓜黑星病菌(C7okiaspon'M附 cwc画er/w訓),黄瓜炭疽病(Co〃eto n,c/7wm/agewan'膽), 稻瘟病菌 (gniea )禾口南瓜疫病菌(/V^top/z/Zzora ca/w/"')的最低 抑制浓度(MIC )为3 ~ 5吗/ml ( Kim " a/., 1999 )。在以线粒体作为靶标的37,000个化合物对人类60个肿瘤细胞株 20的抗癌活性试验中，寡霉素是效果最好的37种化合物之一。抗阿霉 素的肿瘤细胞株R-HepG2细胞可产生P-糖蛋白，积累的阿霉素比亲 代细胞少。寡霉素可阻止P-糖蛋白的活性，使R-HepG2细胞积累更 多阿霉素，从而引发细胞的程序性死亡(LiW"/.,2004)。 Korystov等 在2003年发现，寡霉素ABC的混合物在浓度为3 pg/ml时开始抑制 25小鼠P388淋巴性白血病细胞的存活，在30pg/ml (即38pM)时使 细胞存活率下降到54%。这些浓度比完全抑制各种细胞呼吸作用所需浓度(80 ~ 300 nM ) ( Currie " 1965 )要低1000倍以上。寡霉素A对P388细胞的生长抑制作用与寡霉素ABC的混合物类似，但 是抑制浓度更低，即寡霉素A在lpg/ml时就开始抑制细胞的存活， 在10pg/ml时达到最大抑制率(Korystov"a/.,2003)。因此，寡霉素 5 A作为抗肿瘤剂极具应用潜力。寡霉素是哺乳动物细胞氧化磷酸化的抑制剂。它能有效地结合线 粒体FoF,ATP合酶的功能亚基F(),使ATP合酶的构型发生改变，从 而抑制了线粒体膜间隙的质子流回流到线粒体基质，其结果是ATP 的合成被阻断，造成生物代谢所需能量的不足，因此寡霉素对哺乳动io物具有很强的毒性(Pinna1967)。寡霉素ABC混合物完全抑制 各种细胞呼吸作用所需浓度为80 300nM(按寡霉素ABC混合物的 平均分子量为791计算，则相当于0.0632-0.237 |ug/ml)(Currie"a/., 1965)。由于寡霉素的毒性，使得它们未在临床上被应用。然而，作 为ATP合酶的抑制剂，寡霉素具有重要的科学意义。Lardy等是将寡15霉素应用到科研实验工作的先锋人物(Lardy etal., 1958 ),这为后来 氧化磷酸化过程的阐明做出了巨大的贡献(Lardy Wfl/.， 1969; 1975 )。 细胞生物能量的改变与许多疾病过程有关，对真核细胞产生大部分 ATP的酶-F1F0-ATP合酶进行调节，可望用于这些疾病的治疗 (Johnson "fl/.， 2006)。线粒体是程序性死亡的关键性调节因素，这20意味着线粒体可以作为癌症治疗的靶标。因此，作为线粒体氧化嫌酸 化抑制剂的寡霉素，被广泛应用于氧化磷酸化、与线粒体功能紊乱有 关的疾病(Angelin""/.,2007)、以及程序性死亡等的相关研究当中 (Dairaku " a/., 2004; Karawajew d a/., 2005; Hanada " a/" 2006 )。在 科学研究上具有重要应用意义的寡霉素早已作为化学试剂被销售，价25 格昂贵，具有一定的经济价值。在寡霉素A、 B和C各组分中，寡霉 素A的抗真菌活性和抗肿瘤活性最强。因此，除寡霉素ABC混合物 夕卜，寡霉素A是最广泛应用于科学研究的一个组分。由于寡霉素A比寡霉素ABC混合物的生产成本更高，因此巿售价格更高。寡霉素A是分离得到的第一个寡霉素家族的抗生素，由淀粉酶 产色链霉菌(S. (^astotoc/2ramoge"&s)产生(Smith W a/., 1954 )。后来， 人们从其他链霉菌，例如阿维链霉菌(5^eptowyc^ m^nmWfe ) (Ikeda 5 " a/.， 1993a)， 51. /Aa"/ (Kim W a/.， 1999)和浅灰链霉菌(& ) (Grammatikova " a/.， 2003)，也分离得到了寡霉素A。在已报道的野 生型阿维链霉菌菌株中，寡霉素A的产量很低(Ikeda a a/., 1993a; 1993b )。
技术实现思路
io 针对上述问题，本专利技术目的是提供一种能生产寡霉素A的菌株。本专利技术的另一个目的是提供应用本专利技术菌株生产寡霉素A的方法。本专利技术提供的高产寡霉素A的阿维链霉菌(5^印tom;/CM avewn力'fe) L033菌株(阿维链霉菌也称为除虫链霉菌；拉丁文名称 15简称&m^m^fe)，已于2008年9月26曰保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),保藏编号为CGMCC No. 2678。L033菌株在有机培养基上一般生长良好，形成丰富的气生菌丝 和基内菌丝。光学显微镜下可见基丝无断裂，无横隔。通过制作电镜20 样品并进行扫描电镜观察，可见L033菌株的孢子丝呈螺旋形，每条 孢子链可含有大于35个孢子。孢子呈球形、卵形、或柱状，表面光 滑，大小为0.65-1.0 x 0.75-1.6 nm。菌丝直径为0.75 ~ 1.5 pm。唯一 碳源利用试验表明，L033菌株能利用L(+)-阿拉伯糖，D-木糖，葡萄 糖，D-果糖，L(+)-鼠李糖，棉子糖，甘露醇，肌醇，柠檬酸纳，D-25半乳糖，甘油，麦芽糖，乳糖，D-甘露糖，不能利用蔗糖，松三糖， L(-)-山梨糖，菊糖。可以使牛奶胨化，但不能使牛奶凝固。可使明胶 液化，能产生黑色素和硫化氢，不能分解纤维素。抗生素抗性测定的结果表明，L033菌株对安普霉素、硫链丝菌素、链霉素、卡那霉素 和氯霉素敏感，对氨节青霉素和萘啶酮酸不敏感。以L033菌株的总DNA为模板，以￡. co/z' 16S rRNA的基因序列 保守区域的序列合成的引物1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3) 5 和Eubac27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')为引物，进行了 16SrDNA的几乎完全序列的扩增。PCR产物长约1.5 kb，与预期的 一致。经过测序可知，该PCR产物全长1487bp。将该序列与GenBank 中的数据进行BLAST分析，将紧密相关的菌株的16S rDNA序列进 行比较，结果显示L033菌株的16S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种阿维链霉菌菌株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）Ｌ０３３，保藏号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２６７８。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李季伦，林秀萍，文莹，陈芝，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]