一种提高阿维菌素产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高阿维菌素产量的方法。它包括如下步骤：1)将阿维链霉菌孢子溶液用纳秒脉冲功率技术刺激处理；2)将步骤1)处理的所述阿维链霉菌孢子溶液置于培养基中培养，使合成的阿维菌素产量得到提高。本发明专利技术采用纳秒脉冲功率技术处理阿维链霉菌孢子，有效上调产生阿维菌素的关键基因aveR和malE的表达，促进阿维菌素的生物合成过程，同时还能够明显缩短阿维链霉菌的发酵周期，大幅度提高阿维菌素产量，克服阿维链霉菌现有发酵技术存在的周期长、效价低的不足的问题，同时纳秒脉冲功率技术装置耗能很低，操作简便，有效降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于生物

技术介绍
阿维菌素(Avermectins, AVM)是由格兰氏阳性菌阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)产生的一类十六元环大环内脂类抗生素。根据连接基团的不同，把阿维菌素分成8个组分即Ala、A2a、Alb、A2b、Bla、B2a、Blb和B2b，其结构差异主要集中在3个部位即C5、C22-C23及C26上，其中BI组分活性最大，尤以Bla的驱虫活性最强。阿维菌素具有高效、安全、农、牧、医三用等特点，阿维菌素是目前世界上公认的最有效的无公害生物杀虫剂之一，在常用剂量下对人畜安全，不破坏生态系统。随着人们生活水平的不断提高以及人们对绿色食品的需求，生物农药在市场需求中倍受青睐。目前，阿维菌素在基因水平上的生物合成研究已经取得了突破性的进展，其大部分生物合成途径得到阐明，相关的阿维菌素生物合成基因簇已经被成功克隆，且多数基因的功能也基本明确。尤其是对产生阿维菌素的关键调控基因和功能基因的研究也取得了较大的进展，陆续发现了调控阿维菌素产量的相应关键基因，如aveR, malE, sig25and orfX等。现今，关于提高阿维链霉菌发酵效价及缩短发酵周期的主要技术手段包括:利用各种诱变剂(紫外线UV、亚硝酸HN03)处理微生物细胞，提高细胞基因突变频率，筛选高产菌株；基因工程技术定向改造细胞，获得高产菌株；优化菌株发酵培养条件，提高菌体发酵效价等。但是，这些技术手段在实际应用中都存在着不少缺点。例如，诱变剂容易诱导菌株发生耐受性，从而导致负突变大量增加，正突变急剧减少甚至消失。基因工程菌的应用主要受限于人们对阿维链霉菌基因结构的研究进展程度，由于现在其基因结构还未完全被彻底得到阐明，因此至今还无法构建成熟稳定的工程菌；对于确定的菌株来说，当其生长因子、无机盐、温度等外界因素达到最优组合时，则不能继续提高其抗生素产量。总之，到目前为止，以上技术手段还不能稳定、有效地缩短阿维链霉菌发酵周期，阿维菌素产量提高从而受到限制，这种现状已经成为制约阿维菌素工业发展的一个主要瓶颈问题。纳秒脉冲电场技术是21世纪新兴物理技术，它具有脉宽短(ns)，场强高(kV/cm)，能量低(mj/cc)，作用前后不会产生热量变化等众多特点。近期，纳秒脉冲电场在肿瘤治疗、协同化疗药物杀伤肿瘤，细胞内钙离子调控、血小板凝胶、细胞膜通透性调控等众多生物医学领域引起了学者们的广泛关注。尤其在近期的研究中发现脉冲电场能够有效促进梭梭树种子的萌发、拟南芥的生长发育以及软骨细胞的增殖效果，但机制还有待进一步研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，本专利技术采用纳秒脉冲功率技术处理阿维链霉菌孢子能有效上调产生阿维菌素的关键基因aveR和malE的表达，促进阿维菌素的生物合成过程；同时，还能够明显缩短阿维链霉菌的发酵周期，大幅度提高阿维菌素产量。本专利技术提供的提高阿维链霉菌产生阿维菌素的量的方法，包括如下步骤:1)将阿维链霉菌孢子溶液用纳秒脉冲功率技术刺激处理；2)将步骤I)处理的所述阿维链霉菌孢子溶液置于培养基中培养，使合成的阿维菌素产量得到提高。本专利技术中，所述阿维链霉菌孢子代谢产生阿维链霉菌，阿维链霉菌合成阿维菌素。本专利技术中，所述纳秒脉冲功率技术为非热效应的脉冲电场序列。上述的方法中，所述纳秒脉冲功率技术的脉冲宽度可为30?100ns，具体可为10ns ；所述纳秒脉冲功率技术的电场强度可为5?20kV/cm，具体可为5kV/cm、10kV/cm、15kV/cm、10 ?15kV/cm 或 5 ?15kV/cm ； 所述纳秒脉冲功率技术的脉冲频率可为0.1?2Hz，具体可为IHz。上述的方法中，步骤2)中，所述培养的周期可为9?lld，具体可为9d，经过纳秒脉冲功率技术刺激后阿维菌素产量平台期出现时间从原来的第7天提早到现在的第5天。上述的方法中，所述纳秒脉冲功率技术采用纳秒脉冲电场发生器。上述的方法中，所述阿维链霉菌孢子溶液的制备过程为将长有所述阿维链霉菌孢子的平板培养基用PBS缓冲溶液冲洗，过滤掉阿维链霉菌的菌丝，即得到纯的所述阿维链霉菌孢子溶液。上述的方法中，所述阿维链霉菌采用ATCC31267型菌株。本专利技术中，所述PBS 缓冲溶液的组成为 NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO4 1.44g/L和KH2PO4 0.24g/L，所述PBS缓冲溶液的PH为7.4 ;使用前需经高温灭菌。本专利技术中，除了纳秒脉冲功率技术处理外，培养阿维链霉菌和分离获得阿维菌素的方法，与现有技术相同。本专利技术具有以下优点:本专利技术采用纳秒脉冲功率技术处理阿维链霉菌孢子，有效上调产生阿维菌素的关键基因aveR和malE的表达，促进阿维菌素的生物合成过程，同时还能够明显缩短阿维链霉菌的发酵周期，大幅度提高阿维菌素产量，克服阿维链霉菌现有发酵技术存在的周期长、效价低的不足的问题，同时纳秒脉冲功率技术装置耗能很低，操作简便，有效降低生产成本。【附图说明】图1为本专利技术实施例中采用的纳秒脉冲功率技术的装置图。图2为本专利技术实施例1中对阿维菌素产量的检测，其中图2(a)为检测阿维菌素在紫外波段OD = 245nm处的典型特征吸收峰，图2 (b)为纳秒脉冲功率技术处理使阿维链霉菌产量平台期缩短检测结果柱状图。图3为本专利技术实施例1中实时定量RT-PCR技术检测纳秒脉冲功率技术刺激阿维链霉菌后的关键基因表达变化情况柱状图，其中图3(a)为aveR基因表达的结果，图3(b)为malE基因表达的结果，图3 (c)为sig25基因表达的结果。图4位本专利技术纳秒脉冲功率技术刺激前后的阿维链霉菌在固体培养基上分别培养了 1、3、5、7和9天的形态学变化，其中C代表对照组阿维链霉菌，5、10和1当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高阿维链霉菌产生阿维菌素的量的方法，包括如下步骤：1)将阿维链霉菌孢子溶液用纳秒脉冲功率技术刺激处理；2)将步骤1)处理的所述阿维链霉菌孢子溶液置于培养基中培养，使阿维菌素产量得到提高。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：国晋菘，张珏，方竞，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11