本发明专利技术公开了一株高产３－羟基丁酮的短小芽孢杆菌，名为Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ＸＨ１９５，于２００４年１月２７日保藏于“德国微生物菌种保藏中心”，保藏号为ＤＳＭ １６１８７。该菌的细菌学特征是：形态为棒杆状，长１．５μｍ～３．０μｍ，直径０．６μｍ～０．７μｍ，菌落颜色为黄色或白色，具有典型的短小芽孢杆菌的生理生化特征和典型的芽孢杆菌的脂肪酸图谱。利用该菌株以葡萄糖或蔗糖为底物在３７℃条件下摇瓶培养６０ｈ分别可产生６３．０ｇ／Ｌ或５８．１ｇ／Ｌ的３－羟基丁酮。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一株短小芽孢杆菌，尤其涉及一株高产3-羟基丁酮的短小芽孢杆菌。
技术介绍
3-羟基丁酮是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料，是国际上常用的香料品种，主要用作配置奶油、乳品、酸奶和草莓等香型的香料。3-羟基丁酮具有令人愉快的奶油香味，多用作奶油、干酪、咖啡、坚果等食品的香味增强剂；它还可以改变啤酒的风味，确定奶酪发酵过程中的香味等。现在人们生活水平日益提高，奶制品消费不断增长，对其口味也有进一步的要求，利用奶油香味改善食品的口味已成为时尚。现在3-羟基丁酮食用香料产品的研究开发已经引起国内外生产厂家和科研机构的重视。目前，国外3-羟基丁酮实验室制备工艺主要有从含有3-羟基丁酮的植物中萃取的方法、生物法、在催化剂条件下氧化丁酮法、电化学氧化丁酮法和在硫酸水溶液中用铊盐水解直链酮类的方法、以丁二酮或2，3-丁二醇为原料合成等方法。有关3-羟基丁酮生产的研究，早在20世纪初就有报道，其方法是通过锌和酸部分还原丁二酮；另一种3-羟基丁酮合成方法是通过2，3-丁二醇选择性氧化得到。近年来，有许多关于用生物法制备3-羟基丁酮的报道，如通过山梨糖菌或生膜菌作用于2，3-丁二醇，或者通过曲霉菌、青霉菌等真菌作用于甘蔗汁，这些工艺方法目前只是处在实验室研究中。但由于环保需求以及未来社会绿色化工的需要，这些生物合成法将是未来的主要研究方向。国内外3-羟基丁酮工业化生产方法主要是采用以丁二酮为原料的化学合成法。1989年日本Ehime大学在Zn-ZnCl-EtOH体系中还原丁二酮得到相应的3-羟基丁酮。该方法是在常压下加热回流进行反应，再经过进一步的分离、纯化即可得到3-羟基丁酮。回流温度在70～80℃左右，产品收率为71％。1992年我国杭州大学开发了用NaHSe还原制备3-羟基丁酮的方法。该方法是在硼氢化钠溶液中加入硒粉，抽真空后反应生成NaHSe，然后再加入乙酸和乙醇的混合液体以及溶解在四氢呋喃中的丁二酮，室温下搅拌反应。产品得率为57％。1998年英国Witwatersrand大学的Martin Studer等应用经过10，11-二氢金鸡纳(HCD)改性的铂作为催化剂选择性地加氢还原丁二酮。他们先将丁二酮、催化剂以及在甲苯溶剂中的HCD加入到高压反应釜中，反应压力为10.7MPa，温度为0～25℃，反应进行10min左右停止，产品收率为85％，可以获得具有一定旋光性的产品。这是一个催化加氢反应，反应条件的控制十分关键，如果继续反应，3-羟基丁酮将进一步转化为2，3-丁二醇，产品收率只有50％。英国Hull大学的J.A.Slipszenko等也开展了以铂为催化剂选择性地催化加氢还原丁二酮的研究。但他们所用的溶剂为二氯甲烷，反应压力为1MPa，反应温度为5～25℃，其产率为85％，在反应中对反应时间以及氢气分压进行一定的控制，可以使(R)-3-羟基丁酮的对映体过量，产率达70％。催化加氢反应需要在高压下进行，设备要求高，而且反应所用催化剂是贵金属，价格昂贵，对于催化剂的制备、改性以及中毒、再生等一系列问题尚未解决，目前尚处于实验室研究阶段，还不能工业化。1992年，美国的Hummel等应用微生物菌体中的酶作为生物催化剂进行还原反应。该方法是培养乳酸杆菌或酵母菌以获得丁二酮还原酶，并在pH值为5、温度为70℃的条件下，应用该还原酶及辅酶NADPH催化丁二酮还原为3-羟基丁酮，其产率最高达100％。由于许多酶的催化具有立体专一性，催化反应仅生成某一构型的手性产物，而不产生对映体或对映体量极少。这种利用还原酶进行还原反应其优势十分明显，可以获得高选择性、高产率的产品，而且产品应用于食品添加剂也更加安全无毒，容易实现工业化。但这一方法的关键步骤就是要能够培养出反应所需的丁二酮还原酶，对于这种生物合成的方法，目前国外报道比较多，在强调绿色化工的今天，这是一个非常重要的研究方向。微生物发酵法生产3-羟基丁酮是生物法生产3-羟基丁酮的一个重要分支。以葡萄糖或其它能够转化生成丙酮酸的化合物为底物发酵生产3-羟基丁酮的代谢途径已经研究地比较清楚(附图1)，这为微生物发酵法生产3-羟基丁酮提供了理论指导。虽然有很多国外关于微生物发酵法生产3-羟基丁酮的文献和少量专利报道，但目前基本上都只处在实验室上游研究阶段；国内也有很少这方面的研究工作，但结果不详。从自然界中筛选分离高产3-羟基丁酮的微生物菌种是发酵法生产3-羟基丁酮工作中重要的一环。现在人们已发现的可以产生3-羟基丁酮的菌种有肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、肠膜状明串珠菌(Leuconoctoc mesenteroides)、乳酸明串珠菌(Leuconoctoc lactis)、酒明串珠菌(Leuconoctoc oenos)、假肠膜状明串珠菌(Leuconoctoc pseudomesenteroides)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、季氏有胞汉逊酵母(Hanseniaspora guillieromondii)、卡尔斯伯氏酿酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、路氏酿酒酵母(Saccharomycodes ludwigii拜尔结合酵母(Zygosaccharomyces bailli)、发酵性结合酵母(Zygosaccharomycesfermentati)等。但是上述所有涉及的菌种都存在3-羟基丁酮的发酵浓度较低的问题，或者3-羟基丁酮只是作为发酵生产2，3-丁二醇的副产物。这些原因导致难以利用上述微生物菌种工业化发酵生产3-羟基丁酮。上述从植物中提取3-羟基丁酮的方法的原料来源有限，且原料中3-羟基丁酮的含量太低，提取成本太高，无法实现工业化；化学合成法普遍存在较严峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对设备要求较高，且产品不是绿色天然的；生物合成法，包括微生物发酵法等大多因菌种、酶活、发酵条件优化及过程控制等等问题使得产物浓度太低，现在只处于实验室研究阶段，还未见工业化报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有生产3-羟基丁酮方法中的技术难点及存在的问题，提供一株新分离的以葡萄糖或蔗糖为底物高产3-羟基丁酮的短小芽孢杆菌，可以用此菌株发酵生产3-羟基丁酮。本专利技术涉及的短小芽孢杆本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株高产３－羟基丁酮的短小芽孢杆菌，其特征在于：该短小芽孢杆菌名为ＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓＸＨ１９５，２００４年１月２７日保藏于“德国微生物菌种保藏中心”，其保藏号为ＤＳＭ１６１８７，该短小芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐ ｕｍｉｌｕｓＸＨ１９５ＤＳＭ１６１８７菌株）细菌学特征是：形态为棒杆状，长１．５～３．０μｍ，直径０．６～０．７μｍ，菌落颜色为黄色或白色，产芽孢，ＶＰ反应呈阳性，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖产酸，可水解酪蛋白、明 胶、吐温８０，可利用柠檬酸盐，可在质量百分比为１０％的ＮａＣｌ中生长，可在５０℃下生长，所述ＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓＸＨ１９５ＤＳＭ１６１８７菌株的脂肪酸图谱是典型的芽孢杆菌的脂肪酸图谱，所述Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍ ｉｌｕｓＸＨ１９５ＤＳＭ１６１８７菌株的１６ＳｒＤＮＡ序列与其它不同种的短小芽孢杆菌的１６ＳｒＤＮＡ序列有９８．７～１００％的相似性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许平，肖梓军，杜毅，魏中浩，
申请(专利权)人：上海爱普香料有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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