一种防病植物内生枯草芽孢杆菌制造技术

本发明专利技术涉及一种植物内生枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及其应用，属于农作物防病控病技术领域。本发明专利技术采用的枯草芽孢杆菌菌株Ｊａａｓ　　ｅｄｌ已于２００５年１２月１２日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．１５６４。该菌株可在较低的菌液浓度下进入多种作物体内，并能在多种作物体内定殖；可用于防治植物不同类型的病害，特别是对于土传维管束病害具有良好的防治效果；并且该菌株对植物具有明显的促进生长作用，还能产生多种抗菌代谢产物。具有成本低廉、操作简单、无污染、无公害等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用，属于农作物防病控病

技术介绍
植物内生细菌是能在健康植物组织内栖居，对植物不造成实质性危害而与植物建立了和谐联合关系的微生物。一部分植物内生细菌还能使植物获益，如固氮，促进植物生长或诱导植物抗病性等。实际上五十多年前已有关于植物体内存在内生细菌而不引起植物病症的报道。从早期的研究至20世纪90年代，据不完全文献统计，已从近30种植物中分离了近60个属的内生细菌，其中约有2/3为革兰氏阴性细菌，因此人们开始意识到大多数高等植物中普遍存在内生细菌。植物-内生细菌这种和谐共生，互利共栖的生命形式，可能是未来生态型农业发展的一条重要思路。所以，开展植物内生细菌的研究不仅对植物微生物学科的基础研究有重要的理论价值，而且对农业可持续发展也有重要的实践意义。近年来的研究结果表明植物内生细菌不仅将栖居植物作为其栖息的场所，而且对栖居植物具有促生、防病、固氮等生物学作用，同时内生细菌还是将外源基因导入植物体内的良好载体。因此，植物内生细菌是植物病虫害生物防治的天然资源菌，具有十分重要的理论研究和开发应用价值。植物内生细菌可以通过自然孔口和伤口进入植物体内，一株内生细菌可以在多种植物体内栖居生存。植物内生细菌与从土壤中分离到的拮抗细菌相比，具有不易受环境条件的影响，在植物体内具有稳定的生存空间，可以在植物体内独立的分裂繁殖和传递等优势，筛选有益的内生细菌有可能成为生物防治中最具潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利用。利用内生细菌对土传维管束病害进行生物防治的优势更为突出，由于土传维管束病害的病原菌侵染后，就在寄主植物维管束中生长、繁殖、为害，造成化学药剂防治困难，效果不理想又污染环境，而内生细菌可以通过在植物体内定殖，与病原菌争夺生存空间，产生拮抗物质直接对病原菌作用等方式达到防病控病的目的。近来，随着农药带来的毒性、残留和抗药性问题日益突显，人们对食品安全与生物安全问题的认识不断深化和提高，生物防治越来越受到重视。而植物内生细菌在与栖居植物长期协同进化的过程中形成了密切的相互关系，且生存微环境稳定，是化肥、农药和其他微生物制剂的最佳竞争者，它的合理使用将减少化学农药造成的环境污染，提高农业生态系统中的生物多样性，有利于保护生态平衡实现可持续性发展，适合我国无公害农产品生产的要求。具有抗病作用的枯草芽孢杆菌的报道虽已经有一些，但多为植物根际微生物，从植物组织内分离获得的防病内生性枯草芽孢杆菌还很少，从茄子组织中分离获得能在多种作物体内定殖，具有防病促生作用，还能产生多种抗菌代谢产物的枯草芽孢杆菌还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够在多种植物体内定殖、具有防病促生长作用的植物内生枯草芽孢杆菌，从而能开发出新型的生防菌剂，满足无公害农产品生产的要求。本专利技术所提供的植物内生细菌Jaas ed1是2004年从中国江苏省南京市麒麟镇茄子组织中分离获得的，2005年对该菌株进行了菌种鉴定，结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并于2005年12月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1564。该菌株具有下述性质1.菌落形态特征该菌株在NA培养基上生长良好，菌落呈不规则状，乳白色、扁平微隆起，表面有皱褶，边缘裂叶状。2.菌体形态与主要生理生化特征菌体形态与主要生理生化特征如表1所示。表1内生细菌菌株Jaas ed1形态、生理生化特征 3.遗传学特征以Eubac27F和Eubac1492R为引物进行PCR扩增出的该菌株的16S rRNA基因的部分序列1428bp，并向GenBank提交，登录号为EF178293。该菌株的16S rRNA基因的部分序列如序列表中SEQ ID NO1所示。将该序列在www.ncbi.nlm.nih.gov网站上用BLAST工具与GenBank中已登录的部分菌株的16S rRNA基因序列进行相似性比较，结果表明与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的同源性为99.1％。分子生物学鉴定的结果与中国科学院微生物研究所对该菌株进行的形态特征、生理生化鉴定结果相一致，本专利技术所述的植物内生细菌Jaas ed1属于Bacillus subtilis。通过常规的微生物发酵方法可以培养本专利技术所述的植物内生细菌枯草芽孢杆菌Jaas ed1，并制得以本专利技术所述的植物内生细菌为有效成分的生防菌剂。该菌的最适pH为6.5-8.0，最适培养温度为25-30℃，可用一般发酵工业中的通用发酵罐进行培养。在制造以本专利技术所述的植物内生细菌为生防菌剂时，可同样使用该
中已知生防菌剂通用的培养基，配制成水剂、粉剂等任意的剂型。本专利技术的所述的植物内生枯草芽孢杆菌及制得的以其为有效成分的生防菌剂与现有技术相比具有如下优点。1、可以在多种植株体内定殖传导。将本专利技术所述的植物内生枯草芽孢杆菌用抗利福平与拮抗病原真菌双标记进行内生测定，几天后从植株体内回收分离。结果表明该菌株可以在多种作物体内定殖，并且可以在植株体内向上和向下传导。2、可以促进植株生长、提高产量。用本专利技术所述的植物内生枯草芽孢杆菌菌液泼浇茄子苗，可显著提高植株的苗高和鲜重。3、对土传维管束病害具有突出的防治效果。用本专利技术所述的植物内生枯草芽孢杆菌菌液对植株进行灌根对茄子黄萎病等土传维管束病害具有突出的防治效果。4、对多种作物病原菌具有拮抗活性。室内拮抗活性测定结果表明本专利技术所述的植物内生枯草芽孢杆菌具有较广的抑菌谱，对油菜菌核病菌、水稻稻瘟病菌、棉花立枯病菌、小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌、棉花炭疽病菌、棉花红腐病菌、水稻恶苗病菌、棉花枯萎病菌、茄子黄萎病菌、棉花黄萎病菌等病原真菌以及番茄斑萎病菌等病原细菌都具有拮抗活性。5、产生多种抗菌代谢产物。本专利技术所述的植物内生枯草芽孢杆菌能够产生多种抗菌活性物质，包括产生挥发性的具有抗菌活性的气体，以及能被硫酸铵沉淀的具有抗菌活性的蛋白类代谢产物。并且所产生的具有抗菌活性的蛋白类代谢产物具有抑菌谱广、耐高温、耐高压、耐碱性等优点。具体实施例方式下面用实施例来进一步详述本专利技术，但本专利技术的内容并不局限于此。实施例1 液体制剂将植物内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Jaas ed1菌株接种到试管斜面上，培养基为NA，25℃恒温培养2-4天，获得试管种。将试管种接种到NB培养基中，30℃恒温振荡培养过夜后，转接于NB培养基中，30℃恒温振荡培养3-4天后的培养液即可为制剂。也可转接至发酵培养基为玉米粉培养基的发酵罐中进行发酵生产，用此用玉米粉培养基发酵培养可以同时满足高菌体生长量、高抗菌活性物质产生量以及高芽孢得率的要求。配方一、普通细菌NA培养基(重量％)牛肉浸膏0.3％， 酵母膏0.1％， 蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，琼脂1.5-2.0％，pH 6.8-7.0。配方二、普通细菌NB培养基(重量％)牛肉浸膏0.3％， 酵母膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，pH 6.8-7.0。配方三、玉米粉培养基(重量％)玉米粉1.5％，山芋淀粉0.5％，豆粕粉0.5％，蛋白胨0.8％，MgSO40.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有防病作用的植物内生细菌，其特征在于：该菌是一种枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ），已于２００５年１２月１２日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为ＣＧＭＣＣＮｏ．１５６４。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林玲，乔勇升，周益军，顾本康，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]