本发明专利技术提供开发用于控制由苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)引起的植物病害的基于有毒噬菌体的治疗的方法。本发明专利技术还提供分离和繁殖在黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌宿主中对苛养木杆菌(X.fastidiosain)有毒的噬菌体和用于治疗或减少植物中苛养木杆菌感染症状的方法。本发明专利技术还提供分离和繁殖对地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)有毒的噬菌体和用于治疗或减少植物中地毯草黄单胞菌柑橘致病变种感染症状的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】用于治疗和控制植物病害的方法和组合物 相关申请的交叉引用 本申请要求于2012年10月19日提交的美国临时申请号61/716, 245和于2013 年3月14日提交的美国临时申请号61/785,535的权益，二者通过引用完全结合于此。 关于联邦政府资助的研宄的声明 依照下述，美国政府享有本专利技术的某些权利：动植物卫生检验局（APHIS)关于 德克萨斯皮尔斯疾病研宄与教育项目（Texas Pierce' s Disease Research&Education Program)的合作协议奖，协议号为11-8500-0955-CA，授予AgriLife研宄；和Otsuka制药 有限公司（Otsuka Pharmaceutical Co.，LTD)，协议号为 406039,授予 AgriLife 研宄。 序列表的并入 命名为"TAMC019W0_ST25. txt"的文件中所包含的序列表以电子形式提交并且通 过引用结合在本文中，该文件在Microsoft Windows操作系统中测量为907kb，并且是在 2013年10月17日生成的。 专利
本专利技术涉及植物病理学领域。更具体地，本专利技术涉及用于分离噬菌体和用于治疗 由苛养木杆菌（Xylella fastidiosa)和地毯草黄单胞菌（Xanthomonas axonopodis)引起 的植物病害的方法和组合物，包括作为细菌病毒的噬菌体的应用。 专利技术背景 在植物中，细菌可能引起多种病害，包括葡萄藤的皮尔斯病（Pierce' s Disease) 和柑橘属植物的柑橘溃疡（Citrus Canker)。细菌感染植物组织，并且可能引起萎蔫、生长 差、损害果实，甚至是植物死亡。感染可能通过风、雨、被污染的设备或媒介昆虫传播而发 生，其迅速地传播到其他植物上，并且导致对所述植物的有害的作用和大量的农作物损失。 这些病害的有效治疗需要一种治疗植物消除细菌的方法。 专利技术概述 在一方面，本专利技术提供繁殖其宿主范围包括苛养木杆菌（X. fastidiosain)的有 毒菌体（bacteriophage或phage)的方法，所述方法包括用所述·菌体感染黄单胞菌属 (Xanthomonas)细菌的培养物，允许所述噬菌体繁殖，并且从所述培养物中分离噬菌体颗 粒。在另一个实施方案中，所述黄单胞菌属细菌包括物种菌株EC-12。在另一个实施方案 中，所述噬菌体通过结合细胞表面特征而感染细胞。在另一个实施方案中，所述细胞表面特 征是IV型菌毛。在另一个实施方案中，所述菌体包括来自由podophage、siphophage和 myophage组成的组的有尾噬菌体。在其他实施方案中，所述噬菌体是从环境、污水处理厂或 流出物、植物或其表面或从环境土壤中分离的。在本专利技术的其他实施方案中，利用替代宿主 (surrogate host)来富集有毒菌体。在另一个实施方案中，所述菌体对苛养木杆菌有 毒。在其他实施方案中，利用琼脂覆盖（agar overlaying)来生长所述·菌体。 在另一方面，本专利技术提供获得用于皮尔斯病的候选生物控制剂的方法，所述方法 包括使苛养木杆菌和黄单胞菌属细菌与包含有毒噬菌体群体的样品接触，并且从所述群体 分离至少第一种能够裂解所述苛养木杆菌和黄单胞菌属细菌的噬菌体。在一个实施方案 中，所述噬菌体通过与细胞表面特征结合而感染细胞。在另一个实施方案中，所述细胞表 面特征是IV型菌毛。在另一个实施方案中，所述细胞表面特征是细菌宿主的发病机制/ 毒力所需要的。其他实施方案包括使苛养木杆菌和黄单胞菌属中的至少一种的菌苔与样 品接触，使苛养木杆菌和黄单胞菌属同时与样品接触，和使苛养木杆菌和黄单胞菌属先后 与样品接触。在其他实施方案中，所述噬菌体是从环境、污水处理厂或流出物、植物或其表 面或从环境土壤中分离的。在另一个实施方案中，所用的噬菌体是对苛养木杆菌（Xylella fastidiosa)有毒的。所述方法还包括在使宿主细菌与有毒噬菌体接触后，检测裂解的细菌 宿主细胞或噬菌斑的形成。在具体的实施方案中，所述方法包括其上已经引入了噬菌体样 品的平板琼脂覆盖物或细菌宿主细胞的平板。 在其他实施方案中，使用含有苛养木杆菌和黄单胞菌属的软琼脂覆盖物来制备噬 菌体，并且在其他实施方案中，通过收集一种或多种包含表现出融合裂解的苛养木杆菌菌 株或黄单胞菌属菌株（如EC-12)的覆盖平板，然后浸离并通过离心来澄清，来制备高滴度 的噬菌体平板裂解物。滤器除菌后，可以保存得到的裂解物，例如，在4°C保存。随后，纯化 高滴度噬菌体裂解物，例如，通过等密度CsCl离心进行，并且将提取的噬菌体溶液进行透 析。得到的CsCl-纯化的噬菌体典型地展现出约lX10 nPFU/ml的滴度。 在一些实施方案中，植物组织滤出液（PTFs)中的噬菌体比率约为ImlPTF :20ml替 代宿主（所选的宿主的活性生长培养物），对于苛养木杆菌菌株Temecula生长4天或对于 黄单胞菌属菌株EC-12生长4小时。 本专利技术的另一方面提供预防或减少植物中与苛养木杆菌相关的症状或病害的方 法，所述方法包括使植物与其宿主范围包括苛养木杆菌的噬菌体接触，其中所述与苛养木 杆菌相关的症状或病害包括典型的皮尔斯病（PD)症状，其中叶片沿着边缘表现出黄色或 红色的现象，最终叶片边缘坏死。在一个实施方案中，可以将噬菌体颗粒引入到植物中。 在另一个实施方案中，所述植物选自由下述组成的组：葡萄藤植物，柑橘属植物，杏树属 (almond)，咖啡树，苜蓿（alfalfa)，夹竹桃（oleander)，栎属树（oak)，香楓（sweetgum)， 紫荆属（redbud)，榆树（elm)，桃树，杏树（apricot)，李属（plum)，黑莓，桑树（mulberry) 和梓柳（Chitalpa tashkentensis)。在另一个实施方案中，菌体通过注射、昆虫媒介 (insect vector)引入到植物中或通过注射经由根系统引入到植物中。在其他实施方案中， 注射包括针头或无针头系统、充气空气（pneumatic air)或压力注射系统。在其他实施方 案中，注射是手工进行的，或者一次，或者多于一次。在另一个实施方案中，所述昆虫媒介是 玻璃翅叶蝴（glassy winged sharpshooter)。在另一个实施方案中，要引入到植物中的· 菌体为1至l〇12PFU/ml (噬菌斑形成单位/ml)、IO4至10 11PFUAil和IO7至10 wPFUAil。在 另一个实施方案中，所述噬菌体颗粒通过下述方法获得：所述方法包括用所述噬菌体感染 黄单胞菌属细菌的培养物，允许所述噬菌体繁殖，并且从所述培养物分离噬菌体颗粒。在另 一个实施方案中，所述方法包括使植物群体与所述噬菌体颗粒接触，以预防或减少与苛养 木杆菌相关的症状。在另一个实施方案中，所述噬菌体包括选自下述Xfas 100噬菌体类型 或Xfas300 菌体类型的菌株中的至少一种菌体（bacteriophage或phage)。 在另一方面，本专利技术提供一种配制递送至植物的植物病害生物控制组合物，所述 组合物包含至少一种稀释剂、辅药或表面活性剂，和至少一种来自下述XfaslOO噬菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种预防或减少植物中由苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)或黄单胞菌属(Xanthomonas)引起的症状或病害的方法，所述方法包括：使所述植物与在其宿主范围中包括苛养木杆菌(X.fastidiosa)和/或黄单胞菌属的有毒噬菌体接触。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：卡洛斯·F·冈萨雷斯，斯蒂芬·J·埃亨，马尤克·达斯，赖兰·F·III·扬，图沙尔·苏沃拉·鲍米克，
申请(专利权)人：德克萨斯AM大学系统，
类型：发明
国别省市：美国;US
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