绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺，从中国农业科学院微生物菌种保存中心购买的标准绿僵菌（Ｍｅｔａｒｒｈｉｚｉｕｍ　　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）菌株，通过生物发酵工程培养，获得含苦马豆素较高的菌丝体和发酵液，采用超声提取、溶剂萃取、薄层色谱、Ｄ１０１树脂、硅胶柱层析及梯度升华等技术，从菌丝体和发酵液中分离提纯出苦马豆素纯品。该工艺制备的苦马豆素呈白色针状结晶，分子量为１７３，熔点１４４～１４５℃，纯度≥９８％。本发明专利技术的工艺，不破坏现有的植物资源，不存在资源匮乏问题，生产周期短，提取成本低，生产量大，产品纯度高，利于工厂化生产，可促进苦马豆素作为抗肿瘤药物及免疫增强剂等药物研发的产业化进程。

【技术实现步骤摘要】
绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及微生物学、生物发酵，天然产物提取、分离和 鉴定方法，特别涉及一种绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺。
技术介绍
苦马豆素的来源有三种途径(1)从植物中提取分离苦马豆素目前已知含苦 马豆素的植物有①豆科苦马豆属植物，如苦马豆、灰苦马豆(Swainsonacanescens)，该属 植物在澳大利亚和我国均有分布灰苦马豆，是首先分离出苦马豆素的植物；②豆科黄芪 属(Astragalas)和棘豆属(Oxytropis)植物，这类植物是国内外研究较多的植物，分布 于世界各地，尤其是北美和我国，资源十分丰富。据不完全统计，这类植物在我国有44 种，其中黄芪属21种，棘豆属23种；③锦葵科黄花稔属(Sida)，如鹅耳枥黄花稔(Sida carpinifolia)，热带美洲和非洲可能是其发源地，在巴西的南部和东南部也发现有大量的 鹅耳枥黄花稔；④旋花科番薯属，Haraguchi M等^00 从Ipomea carnea的叶子、花和种 子中分离出苦马豆素，新鲜叶子和花中的含量分别为0. 00 %和0. 00 %,种子中的含量 大约为叶子和花中含量的10倍。这类植物主要分布于澳大利亚。植物中的苦马豆素相当 稳定，据Molyneux等(1991)]报道，保存15年的斑荚黄芪仍含有苦马豆素。(2)从真菌菌丝体及其培养液中提取分离苦马豆素=Schneider B等(1984)从美 国标准库保存的豆类丝核菌(Miizoctonia Legaminicola)中分离出苦马豆素。Sim K L等 (1997)报道绿僵菌(Metarrhizium anisopliae)中也含有苦马豆素，如果降低绿僵菌培 养液的PH值，可使苦马豆素的浓度增加。Braim K等Q003)从中毒疯草密柔毛黄芪，兰伯 氏棘豆，绢毛棘豆的8个类群的叶、茎、种子和花中分离出内生植物真菌。所有培养的内生 植物都产生导致疯草病的生物碱-苦马豆素。感染内生植物的疯草类群也产生苦马豆素， 而且体外培养的内生植物的苦马豆素水平与宿主植物类群的苦马豆素水平高度相关。(3)人工合成苦马豆素鉴于苦马豆素及其相关化合物在生物化学、免疫学、医学和毒理学等方面的众多 用途，美国的化学家^suda(1984)、Bennett(1989)和我国科学院院士周维善先后对苦马 豆素人工合成进行了研究。由于苦马豆素有4个手性碳原子，即使很好地控制反应，但是合 成的产物中还有16个化学结构相同，而立体构象不同的异构体，要使之分离却十分困难， 整个合成过程有21步，产率仅为6. 6%。苦马豆素的抗肿瘤活性、免疫增强作用及其抗辐射作用是十分明显的，不容质疑。 然而制约苦马豆素作为抗肿瘤药物研发，产品产业化，最终走向临床用药的关键是苦马豆 素纯品的来源十分匮乏，远远不能满足人们研究的需要。植物中苦马豆素含量本身很低，仅 为0. 02%左右，且植物资源受自然因素的影响较大，使得苦马豆素的生产量十分匮乏。化学 合成由于受合成路线及分离技术的限制使得苦马豆素的来源也十分有限，这些都严重的制 约着苦马豆素抗肿瘤活性研究及其产品开发。从真菌菌丝体及其培养液中提取分离苦马豆 素，中国专利公开号CN1396^53，公开日2003年2月12日，专利技术创造的名称为生物发酵提纯苦马豆素的工艺，其所采用的微生物菌株是自行从自然界豆科植物中分离、筛选的可产生 苦马豆素的豆类丝核菌7-3菌株(代号)，但没有公开豆类丝核菌7-3菌株的具体获得方法 和途径，也没有公开该豆类丝核菌7-3菌株的具体特性、标准、以及品质鉴定方法，同领域 的普通技术人员无法按说明书的内容重复实现；另外，采用生物发酵提取苦马豆素，不仅是 菌丝体中含有苦马豆素，培养液中也含有大量的苦马豆素，而该专利技术的工艺只涉及菌丝体 中苦马豆素的提取，确丢掉了培养液中苦马豆素的提取，使提取苦马豆素的效率降低。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的缺陷和不足，本专利技术的目的在于，提供一种绿僵菌发 酵提纯苦马豆素的工艺，该工艺使苦马豆素原材料来源更为便利，有利于工厂化批量生产， 使生产成本大幅度降低，最终为促进苦马豆素在抗肿瘤药物及免疫增强剂等方面的产业化 提供物质保障。实现上述本专利技术目的的技术方案是一种绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺，该工 艺是将从中国农业科学院微生物菌种保存中心保存的标准菌株一绿僵菌(Metarrhizium anisopliae CCTCC No. M93049D)通过生物发酵，使提取所得到的原材料(菌丝体和培养 液)中苦马豆素得以富集，再经过DlOl大孔树脂和硅胶柱层析、梯度分段升华等技术获得苦马豆素纯品。本专利技术的生物发酵法提纯苦马豆素工艺，具体包括下列步骤1)绿僵菌菌株的保存与传代将绿僵菌接种于高氏合成一号培养基(Gause’ s synthetic Nol)，培养4 6天，待菌种充分生长发育后，置-20°C低温冰箱保存，每1 2 个月传代一次。所述的高氏合成一号培养基的配方组成为硝酸钾lg，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁 0. Olg,磷酸氢二钾0. 5g，氯化钠0. 5g，可溶性淀粉20g,琼脂20g,水IOOOml ；2)绿僵菌接种、发酵培养及菌丝体和培养液收集在无菌状态下，将绿僵菌接种 于生物发酵用改良克氏合成I号培养基，20°C 25°C通气发酵培养10 14天。收集菌丝 体和培养液，干燥，备用；所述改良克氏合成I号培养基的配方组成为可溶性淀粉10g，糊精10g，硝酸钾 2g，磷酸氢二钾2g，氯化钠2g，硫酸镁0. 05g,碳酸钙0. 02g,硫酸亚铁0. Olg,酪蛋白0. 3g， DL-赖氨酸 0. lg,7jC 1000ml ；3)菌丝体中苦马豆素的提取①菌丝体总浸膏提取称取菌丝体，置超声循环提取机，加6 10倍量(重量体积 比)的乙醇，20KHz超声波室温处理4次，每次0. 5 1小时，收集乙醇提取液并分离残留 物，收集的提取液减压回收溶剂，得到菌丝体总浸膏；②苦马豆素粗品提取；上述得到的菌丝体总浸膏，先用3倍量(重量体积 比)ImoL/L盐酸溶解浸膏，滤去不溶物，得到酸水液。将酸水液用浓氨水调pH至9 10，然 后用饱和正丁醇反复萃取4 6次，减压回收溶剂得到苦马豆素粗品。③苦马豆素纯品提取称取苦马豆素粗品，按1 1的比例(重量比)拌等量柱层 析用硅胶，挥干研成细粉末，硅胶柱层析分离，乙酸乙酯一乙醇(1 4，体积比)洗脱，采用 薄层色谱技术监测合并含苦马豆素部分，最后经90 95°C油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品。4)发酵液中苦马豆素的提取发酵液经脱水、浓缩、脱糖、脱蛋白、超声波裂解细 胞等前处理得到的浓缩水溶液，通过DlOl大孔树脂收集蒸馏水洗脱部分，浓缩得到苦马豆 素粗品，然后经硅胶柱层析和减压梯度升华得到苦马豆素纯品。所述的薄层色谱监测技术是硅胶GF2M薄层板点样，氯仿甲醇氨水水 (70 26 2 2，体积比)或乙醇乙酸乙酯O 1，4 1，体积比)上行法展开，以下通过表1来说明本专利技术与现有技术相比的优点表1绿僵菌生物发酵提取苦马豆素工艺与现有技术对比性试验权利要求1. 一种绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺，其特征在于，包括下列步骤1)绿僵菌菌株的保存与传代将绿僵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺，其特征在于，包括下列步骤：１）绿僵菌菌株的保存与传代：将绿僵菌接种于高氏合成一号培养基，培养４～６天，待菌种充分生长发育后，置－２０℃低温冰箱保存，每１～２个月传代一次；所述的高氏合成一号培养基的配方组成为硝酸钾１ｇ，硫酸镁０．５ｇ，硫酸亚铁０．０１ｇ，磷酸氢二钾０．５ｇ，氯化钠０．５ｇ，可溶性淀粉２０ｇ，琼脂２０ｇ，水１０００ｍｌ；２）绿僵菌接种、发酵培养及菌丝体和培养液收集：在无菌状态下，将绿僵菌接种于生物发酵用改良克氏合成Ⅰ号培养基，２０℃～２５℃通气发酵培养１０～１４天，收集菌丝体，干燥，备用；培养液滤去悬浮物，浓缩到一定体积后保存备用；所述改良克氏合成Ⅰ号培养基的配方组成为：可溶性淀粉１０ｇ，糊精１０ｇ，硝酸钾２ｇ，磷酸氢二钾２ｇ，氯化钠２ｇ，硫酸镁０．０５ｇ，碳酸钙０．０２ｇ，硫酸亚铁０．０１ｇ，酪蛋白０．３ｇ，ＤＬ－赖氨酸０．１ｇ，水１０００ｍｌ；３）菌丝体中苦马豆素的提取：①菌丝体总浸膏提取：称取一定量的菌丝体，置超声循环提取机，加６～１０倍量的工业酒精，２０ＫＨｚ超声波室温处理，每次０．５～１小时，更换溶媒相同条件下超声波提取２～３次，收集提取液，减压回收溶剂，得到菌丝体总浸膏；②苦马豆素粗品提取；上述得到的菌丝体总浸膏，先用３倍量１ｍｏＬ／Ｌ盐酸溶解浸膏，滤去不溶物，得到酸水液，将酸水液用浓氨水调ｐＨ至９～１０，然后用饱和正丁醇反复萃取４～６次，减压回收溶剂得到苦马豆素粗品；③苦马豆素纯品提取：称取一定量苦马豆素粗品，按１∶１的比例（重量比）拌等量柱层析用硅胶，挥干研成细粉末，硅胶柱层析分离，乙酸乙酯∶乙醇（１∶４，体积比）洗脱，采用薄层色谱技术监测合并含苦马豆素部分，最后经９０～９５℃油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品；４）发酵液中苦马豆素的提取：发酵液经脱水、浓缩、脱糖、脱蛋白、超声波裂解细胞等前处理得到的浓缩水溶液，通过Ｄ１０１大孔树脂收集蒸馏水洗脱部分，浓缩得到苦马豆素粗品，然后经硅胶柱层析和减压梯度升华得到苦马豆素纯品；所述的薄层色谱监测技术是硅胶ＧＦ２５４薄层板点样，氯仿∶甲醇∶氨水∶水（７０∶２６∶２∶２，体积比）或乙醇∶乙酸乙酯（２∶１，４∶１，体积比）上行法展开，双氧水／１０％醋酐／Ｅｈｒｌｉｃｈ’ｓ试剂喷雾显色。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵宝玉，来航线，王建军，傅艳萍，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]