亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法技术

本发明专利技术提供了亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，属于生物硒制备领域，利用选育出的亚硒酸钠脱毒效率高的保藏号为CGMCC No.9507的酿酒酵母，通过发酵条件优化得到了将高毒亚硒酸钠脱毒转化，生成低毒生物硒的微生物发酵条件。本发明专利技术优点是：本发明专利技术所提供亚硒酸钠脱毒方法可以大幅度减小亚硒酸钠的急性毒性，简单有效，容易操作，所生成的有机生物硒安全性高，更易被人体吸收转化和利用。

Microbial fermentation method for detoxification and transformation of sodium selenite

The present invention provides a method for the microbial fermentation of sodium selenite detoxification transformation, belonging to the field of preparation of biological selenium removal, high efficiency is preserved by the toxicity of Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.9507 using selected sodium selenite, the high toxicity of sodium selenite detoxification to turn through the optimization of fermentation conditions, microbial fermentation conditions generate toxic biological selenium. The advantages of the invention are: the sodium selenite detoxification method provided by the invention can greatly reduce the acute toxicity of sodium selenite, and is simple and effective, and is easy to operate. The generated organic selenium has high safety and is more easily absorbed, transformed and utilized by human body.

【技术实现步骤摘要】
亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法
本专利技术属于微生物发酵
，具体属于一种将高毒亚硒酸钠脱毒转化为低毒生物硒的微生物发酵方法。
技术介绍
硒是人体生命活动中不可缺少的一种微量元素。已有研究表明，硒具有抗氧化、提高机体免疫水平、缓解重金属毒性、抗衰老、防癌抗肿瘤、抗心脑血管疾病等重要的生理作用。人体内硒的总积聚量约15mg，在摄入与排泄中保持动态平衡，联合国卫生组织指出，膳食摄取硒是最理想的补硒方式，天然食物中的硒含量普遍较低，果蔬中硒含量一般小于10μg/kg。我国营养学会推荐正常成人摄入硒的安全和合适范围为50-250μg/d。调查表明，在我国大约有72%的国土呈现出不同程度的缺硒情况，缺硒问题十分严峻，对于广大硒缺乏人群而言，补充硒元素对于预防和辅助治疗硒缺乏相关疾病以及提高人体免疫力有着重要的现实意义。目前，广泛使用的补硒方法是添加无机补硒剂，如亚硒酸钠、亚硒酸氢钠、硒酸钠等。无机硒已成功用于克山病、大骨节病等地方病的防治。但是，应用效果证明亚硒酸钠等无机硒毒性大，活性和毒性范围窄，最低致死量相对较小，利用率相对较低，安全性方面存在较大隐患。因此，通过脱毒转化作用，将亚硒酸钠的毒性大幅减低，并开发新型、保健、低毒、安全的生物硒已经成为目前硒添加剂制备的发展趋势。
技术实现思路
针对目前常用补硒剂亚硒酸钠毒性高、半数致死量小的问题，本专利技术提供一种将高毒亚硒酸钠脱毒转化为低毒生物硒的微生物发酵方法。本专利技术利用微生物菌株，通过该微生物发酵作用将高毒的亚硒酸钠脱毒转化为没有毒性的生物硒，此方法可用于制备高效安全的硒添加剂。本专利技术所述的微生物菌株，是从市售的酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）经过长期选育得到，其将亚硒酸钠脱毒转化的效率较高。该菌株已于2014年8月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCCNo.9507。本专利技术利用保藏号为CGMCCNo.9507的酿酒酵母，在培养基中加入亚硒酸钠，通过酿酒酵母自身的生长代谢繁殖，将原料中添加的高毒亚硒酸钠脱毒转化成生物有机硒。本专利技术利用微生物发酵技术可以将高毒的亚硒酸钠脱毒转化为毒性较低、安全系数更高的天然生物硒添加剂。本专利技术提供一种利用选育的微生物菌株，通过其自身的生长代谢将高毒亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，具体包括如下步骤：（1）菌悬液的制备挑取一环已活化两到三次的微生物菌种于5mL液体培养基中，置于28℃摇床培养24h后成为菌体培养液，取200μL菌体培养液加入液体培养基中，在28℃摇床培养24h成为菌悬液，再从培养好的菌悬液中取2mL加入到无菌水中，在28℃摇床培养，菌液浓度达107cfu/mL时停止培养。（2）亚硒酸钠脱毒转化发酵条件的优化选择硒添加量、培养温度、培养时间、初始pH、接种量、装液量六个因素进行Plackett-Burman试验，研究影响亚硒酸钠脱毒转化的主要因素；采用单因素试验和最陡爬坡试验确定各主要因素水平；采用三因素三水平的响应面试验，研究酿酒酵母的亚硒酸钠脱毒转化的发酵条件，得出亚硒酸钠脱毒转化的最佳发酵条件为亚硒酸钠添加量81.3mg/L、初始pH6.3、培养温度28.6℃，发酵时间30天。（3）生物硒的分离与纯化将经过脱毒转化发酵的生物发酵液经过超声破碎后全部装入透析袋MD34（8000-14000）内，扎紧上端，于蒸馏水中透析得到亚硒酸钠脱毒转化之后的生物硒样品液。（4）硒含量测定采用氢化物-火焰原子吸收法测定透析内生物有机硒样品液中硒含量，测得样品液中生物有机硒含量为1.52mg/kg（以硒计）。（5）生物硒和亚硒酸钠的急性毒性试验结果对比试验选用6～8周龄，体重18～20g的昆明种小白鼠60只，采用改良寇氏法，采用一定浓度的亚硒酸钠溶液和生物硒进行灌胃实验。一次经口灌胃。经口灌胃后，对小白鼠进行观测，记录日常行为、群体行为、毒性表现情况以及死亡情况，观测的周期为两周并记录其异常表现以及死亡状况。根据公式计算半数致死量LD50：i为组距（相邻两试验组的对数的差）；Xm为最大剂量对数；∑P为各剂量组死亡率之和；计算得出亚硒酸钠的半数致死量LD50=21.17mg/kg，根据急性毒性分级标准，亚硒酸钠属于5级（剧毒）。通过微生物发酵作用将亚硒酸钠进行脱毒转化之后得到的生物硒的LD50为935mg/kg，根据急性毒性分级标准，生物硒属于2级（实际无毒），通过本专利技术方法可以显著降低亚硒酸钠的毒性，达到脱毒转化的效果。亚硒酸钠脱毒转化菌株是经过长期选育得到的脱毒转化能力强的微生物菌株，利用微生物自身的合成代谢作用，在微生物培养过程中不断加入可溶于水的高毒无机硒盐（亚硒酸钠），使其通过微生物发酵作用合成硒蛋白、硒氨基酸、硒多糖等生物大分子从而实现亚硒酸钠脱毒转化，经过超声破碎菌体后透析可以得到安全性高的生物硒制品。通过微生物发酵方法将高毒亚硒酸钠脱毒转化得到的生物硒安全性更好，更易被人体吸收、转化和利用，有利于其在食品工业等领域的进一步应用。本专利技术具有操作简便、条件易于控制和实现、脱毒效率高等优点，而且得到的生物硒可以进一步的作为硒添加剂进行应用。具体实施方式以下实施例中使用的酿酒酵母菌株，是从市售的酿酒酵母经过选育得到的，该菌株将无机硒转化为生物有机硒的转化率比较高，该菌株已于2014年8月12日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNo.9507。实施例1亚硒酸钠的脱毒转化（1）菌悬液的制备挑取一环已活化两到三次的菌种于5mL液体培养基中，置于28℃摇床培养24h后成为菌液，取200μL菌液加入液体培养基中，在28℃摇床培养24h为菌悬液，再从培养好的菌悬液中取2mL加入到无菌水中，在28℃摇床培养，菌液浓度达107cfu/mL时停止培养。（2）亚硒酸钠脱毒转化发酵条件优化a.Plackett-Burman法筛选影响亚硒酸钠脱毒转化的主要因素选用N=8的实验设计，对亚硒酸钠添加量（X1）、培养温度（X2）、培养时间（X3）、初始pH（X4）、接种量（X5）、装液量（X6）6个因素进行考察，每个因素分别设高水平和低水平两个水平，高水平是低水平的1.25倍，以亚硒酸钠脱毒转化后生成的生物硒含量(Y)作为响应值，结果表明：亚硒酸钠添加量、初始pH、培养温度、装液量、接种量和培养时间的不同组合对亚硒酸钠脱毒转化生成生物硒的影响各不相同。采用Minitab进行各因素主效应分析，得到6个因素中对响应值影响的显著性顺序为：亚硒酸钠添加量>初始pH>培养温度>装液量>接种量>培养时间。因此，把培养时间、装液量、接种量固定在较好水平上。选择亚硒酸钠添加量、初始pH和培养温度这三个因素进一步做单因素试验和正交试验。b.不同因素对亚硒酸钠脱毒转化为生物硒的影响采用单因素试验法，以亚硒酸钠添加浓度，初始pH，培养温度为自变量，以酿酒酵母生物量和生物硒含量为评价指标，确定每个因素的最佳水平。培养基中其他组分及培养条件保持不变，分别添加不同浓度的亚硒酸钠（60、70、80、90、100、110、120mg/L），测定其本文档来自技高网...

【技术保护点】
亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，其特征是通过微生物发酵作用将高毒的亚硒酸钠脱毒转化为生物硒。

【技术特征摘要】
1.亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，其特征是通过微生物发酵作用将高毒的亚硒酸钠脱毒转化为生物硒。2.根据权利要求1所述的亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，其特征是发酵方法包括如下步骤：（1）菌悬液的制备挑取一环已活化两到三次的生物菌种置于5mL液体培养基中，并置于28℃摇床培养24h后成为菌体培养液，取200μL菌体培养液加入液体培养基并在28℃摇床培养24h成为菌悬液，再从菌悬液中取2mL加入到无菌水中，在28℃摇床培养，菌液浓度达107cfu/mL时停止培养；（2）脱毒转化发酵条件的优化选择硒添加量、培养温度、培养时间、初始pH、接种量、装液量六个因素进行Plackett-Burman试验，研究影响亚硒酸钠脱毒转化的主要因素；采用单因素试验和最陡爬坡试验确定各主要因素水平；采用三因素三水平的响应面试验，研究微生物菌种的亚硒酸钠脱毒转化的发酵条件；通过条件优化得到最佳的脱毒转化发酵条件是亚硒酸钠硒添加量81.3mg/L、初始pH6.3、培养温度28.6℃；（3）脱毒转化之后的微生物中生物硒分离纯化将脱毒转化发酵的生物发酵液经过超声破碎后全部装入透析袋内，扎紧上端，于蒸馏水中透析得到亚硒酸钠脱毒转化的生物硒样品液；（4）硒含量测定采用氢化物-火焰原子吸收法测定透析袋内生物硒样品液中生物硒含量。3.如权利要求2所述亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，其特征是所述的微生物菌株是保藏号为CGMCCNo.9507的酿酒酵母。4.如权利要求1或2所述亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，其特征在于所述生物硒的含量为1.52mg/kg，半数致死量LD50为935mg/kg。5.如权利要求2中所述亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，包括下述内容：a.采用Plackett-Burman法筛选影响亚硒酸钠脱毒转化的主要因素，对亚硒酸钠添加量、培养温度、培养时间、初始pH、接种量、装液量6个因素进...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨钰昆，王兴华，郭园园，常媛媛，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西,14