一株耐高温酿酒酵母菌株及其构建制造技术

本发明专利技术公开了一株耐高温酿酒酵母的筛选和构建方法。以菌株AY12‑G作为出发菌株，进行ARTP等离子诱变，37℃条件下初筛获得150株菌，然后对这150株菌进行基因组重排，37℃条件下初筛获得137株菌。对这137株菌进行35℃玉米水解液发酵，筛选出14株菌，将14株菌进行35℃同步糖化发酵以及测定48h细胞存活率，筛选出7株高温发酵性能以及48h细胞存活率有所提升的菌株，对这7株菌进行41℃以及42℃的高温驯化，最终获得一株高温发酵性能优良，48h细胞存活率显著提升的菌株X‑130。与出发菌株AY12‑G相比，X‑130在48h的细胞存活率提升了84.68％，35℃同步糖化发酵性能并没有明显变化，添加酸性蛋白酶后发酵周期得以缩短12h。

A strain of high temperature resistant Saccharomyces cerevisiae and its construction

【技术实现步骤摘要】
一株耐高温酿酒酵母菌株及其构建
：本专利技术涉及基因工程领域，具体是涉及一株耐高温酿酒酵母菌株及其构建方法。
技术介绍
：燃料乙醇是目前全球公认的最为成熟的汽油代替燃料。作为一种可以再生的液体燃料，燃料乙醇在缓解大气污染、减少温室气体排放、降低对进口石油依赖、激活农村经济以及提高农户收入等方面都起着十分重要的作用，因此在全球多个国家和地区得到了推广使用。燃料乙醇已经成为国际上最为关注的可再生能源之一。2015年全球燃料乙醇的产量达到了983亿升，占总生物液体燃料(包括乙醇、生物柴油和氢化植物油)产量(约1307亿升)的75％，成为全球最主要的液体可再生燃料，也是交通领域公认的汽油代替燃料。20世纪70年代，一些学者在对纤维素发酵产乙醇的研究过程中，为了防止糖积累和终产物的抑制作用，进而提高纤维素酶的催化水解效率，提出了同步糖化发酵(SimultaneousSaccharificationandFermentation，SSF)模式，并受到了广泛的重视。目前主流的干法乙醇工艺都采用了同步糖化发酵技术，即将糖化酶和酵母同时加入发酵罐中，糖化酶将液化工段所获得的糊精进一步分解为酵母可以利用的还原糖，酵母将还原糖转化为乙醇。然而，SSF中有一个最重要的问题就是最佳酶解温度(45℃～50℃)和乙醇的发酵温度(25℃～35℃)不协调，这使得酵母菌的发酵和纤维素的酶解难以同步进行，因此选育耐高温酵母菌是解决这一问题的关键。在乙醇的发酵过程中，当发酵醪液的温度超过38℃时，就必须使用冷却水进行降温，否则就会对酿酒酵母的活性产生抑制，影响乙醇的产率以及还原糖的利用率，增大生产成本。高温发酵具有发酵速度快、更适用于同步糖化发酵工艺、缩短发酵周期、节省冷却水用量、降低发酵原料黏度、降低生产成本等优点，因此，选育耐高温的酿酒酵母菌株在工业应用方面具有重要意义。本研究在酿酒酵母AY12的基因背景下，结合ARTP离子诱变、基因组重排以及高温驯化等育种手段，选育耐高温酿酒酵母。然而关于耐高温酿酒酵母，目前还没有比较成熟的市场化产品。
技术实现思路
：本专利技术解决的技术问题是利用ARTP离子诱变、基因组重排和高温驯化构建出一株耐高温酿酒酵母菌株。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供的酿酒酵母菌株是对高温具有一定耐受性的酵母菌株。获得高耐受酿酒酵母菌株的出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC32315，保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心，公众可购买获得。所述的耐高温酵母在同样的生长条件下与原始菌株相比耐高温能力提高了一倍以上而且耐盐能力明显强于原始菌株。所筛选出的菌株经过驯化后与安琪耐高温干酵母相比乙醇产量也明显提高，而且残糖含量也有所下降。同时细胞存活率也明显提高。由于酿酒酵母的生活史具有特殊性，其单倍体和双倍体细胞均可以以营养体的形式存在。诱变剂处理酿酒酵母的作用是随机的，当处理单倍体细胞时，有可能出现几个基因同时发生突变，但其中某个突变会导致菌株死亡的情况。这就导致了在筛选过程中某些正向突变的丢失；相反，如果用二倍体细胞进行诱变，即使产生了一个致死突变，只要其等位基因没有发生该突变，则菌株依然可以存活下来，从而扩大了突变点的范围。为了成功构建原始突变文库，用于之后的基因组重排，我们最终决定选用二倍体酿酒酵母菌株作为出发菌株。因为与实验室保存菌株AY12和AY15相比，从工业生产菌种中分离出来的菌株AY12-G具有良好的发酵性能以及高温耐受性，故选用菌株AY12-G作为ARTP离子诱变、基因组重排和高温驯化相结合育种实验中的出发菌株。ARTP与分子操作相比，具有操作简便、成本低、无有毒害物质参与诱变过程等优点，其富含的活性能量粒子可以对菌株的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制。SOS修复过程为一种高容错率修复，因此修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株。由于SOS修复强度和DNA受损伤的程度有很大关联，而由umu-test方法可知，ARTP对生物的遗传物质损伤效果明显、损伤机制丰富，尤其是对于染色体等真核生物的遗传物质均有很强的损伤效果，因此，与传统的诱变方法相比，采用ARTP能够有效造成DNA多样性的损伤，突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变株。由此可知，ARTP离子诱变形成的是一类突变，而不是针对酵母基因组某些特定位置的同种改变。这种突变有效的排除了用几种诱变方法导致的对同一位置的作用，保证了突变文库的完善。故ARTP离子诱变符合之后基因组重排的要求，可以用来构建原始突变文库。有益效果：本专利技术提供一种耐高温的酿酒酵母菌株及其构建方法，克服了普通酿酒酵母在胁迫条件下生长不好的问题同时在工业生产上对提高发酵生产效率有重大意义。本专利技术在保证酿酒酵母优良发酵性能的前提下，进行ARTP离子诱变，基因组重排和高温驯化，得到了一株稳定的耐高温酿酒酵母同时细胞存活率和乙醇产量均有所提高本专利技术使用ARTP离子诱变技术，ARTP与分子操作相比，具有操作简便、成本低、无有毒害物质参与诱变过程等优点，其富含的活性能量粒子可以对菌株的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制。SOS修复过程为一种高容错率修复，因此修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株。附图说明：图1为AY12-G的生长曲线图2为AY12-G的致死率曲线图3为重排菌株玉米水解液发酵实验图4为重排菌株同步糖化发酵实验图5为驯化后菌株的生长曲线图6为菌株的耐受性对比图7为基因组重排操作流程图具体实施方式：下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。实施例1：同步糖化发酵确定亲本菌株将安琪耐高温活性干酵母用20g/L的糖水活化后，在YEPD固体平板上划三区以获得酿酒酵母单菌落，用接种针挑取长势较好的单菌落划斜面保存，并将其命名为AY12-G。将AY12-G与本实验室保存菌株AY12、AY15一同进行玉米原料同步糖化发酵，以选取出性能最优菌株作为后续实验的亲本菌株。酿酒酵母接入发酵培养基并于30℃条件下培养12h后，转入35℃，160r/min条件下进行发酵。分别测试各菌株在33℃，35℃条件下的产乙醇能力和还原糖利用能力。在33℃为主发酵温度下，菌株AY12-G的产乙醇能力均略微高于AY12和AY15；35℃为主发酵温度下，菌株AY12-G的产乙醇能力略微高于AY15，明显高于AY12。在两种主发酵温度下，菌株AY12-G的还原糖的利用能力均比菌株AY12和AY15要好，尤其是在35℃条件下。为了能够筛选出更高温度下发酵性能优良的菌株，本实验选定35℃作为主发酵温度。因为AY12在35℃条件下产乙醇能力和还原糖利用能力均比较弱，因此将对AY12-G和AY15继续实验，从两株菌中筛选出亲本菌株。测定AY12-G和AY15在33℃发酵和35℃发酵过程中48h细胞存活率，以从本文档来自技高网...

【技术保护点】
选育出的耐高温酿酒酵母，是通过ARTP离子诱变、基因组重排以及高温驯化的到的。

【技术特征摘要】
1.选育出的耐高温酿酒酵母，是通过ARTP离子诱变、基因组重排以及高温驯化的到的。2.如权利要求1所述的耐高温酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC32315。3.如权利要求1所述的耐高温酿酒酵母菌株，其特征在于，所述的酿酒酵母具有正常的生长和发酵性能，且对高温，盐具有一定耐受性的酵母菌株。4.如权利要求1所述的耐高温酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法是通过ARTP定向离子诱变和基因组重排相结合的方法，选择一株性状稳定的酵母菌株AY12-G作为出发菌株通过诱变和基因重排得到一株耐高温的酵母菌株然后对其进项高温驯化最后的到的结果菌株的细胞存活率和发酵性能都优于出发菌株。5.如权利要求4所述的高耐受酿酒酵母菌株的...

【专利技术属性】
技术研发人员：董健，付肖蒙，肖冬光，郝爱丽，郭学武，张翠英，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12