一种快速利用工业甲醇的毕赤酵母菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能够以工业甲醇为唯一碳源和能源的毕赤酵母菌，其分类命名为巴氏毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＥ－ＳＣＰ０１，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，菌种保藏号为ＣＧＭＣＣ　ＮＯ．２４７７。该菌株属于快速利用甲醇型的毕赤酵母，能够实现高密度细胞培养。利用该菌株可以进行单细胞蛋白的生产。１０００升罐发酵实验表明：在接种量５％的情况下，经过约８５小时的发酵培养，细胞干重达到１２０－１３０克／升，粗蛋白含量达到了约５０％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种能够快速利用工业甲醇的 毕赤酵母菌，利用毕赤酵母菌生产单细胞蛋白的方法以及该毕赤酵母菌的应 用。
技术介绍
单细胞蛋白(Single-Cell Protein, SCP)，又称菌体蛋白或微生物蛋白，是 指通过规模化培养非病源性微生物而生产的用作饲料或食品的菌体蛋白。以工业甲醇为原料生产出来的甲醇蛋白被称为第二代单细胞蛋白，与天 然蛋白相比，它的粗蛋白含量比鱼粉和大豆都要高，含有丰富的必需氨基酸、 矿物质和维生素，可以部分代替鱼粉、大豆、骨粉、肉类以及脱脂奶粉。而 且，甲醇蛋白的原料易得、资源相对丰富、不占耕地、不依靠海洋、生产不 受气候条件影响、生产速度快。2008年4月，联合国粮农组织称，由于许多适合种植粮食的土地，已经 被大量用来建造城市、商业中心、甚至是高尔夫球场，使得全球范围内很多 国家都开始面临粮食危机，亚洲、非洲地区的一些贫困国家首当其冲，目前 全球粮食储备己降至1980年以来的最低水平。而以大豆等粮食为主要原料的 饲料行业也理所当然的受到了严重冲击，因此，以工业甲醇为原料的甲醇蛋 白，作为一种新型生物蛋白饲料正受到了世界范围内的广泛关注。有关专家分析，到2010年和2020年，我国蛋白质饲料年需求量分别为 6000万吨和7200万吨，而供给量仅为2200万吨和2400万吨，供需缺口达 3800万吨和4800万吨。随着市场对蛋白需求的增长，而鱼粉和大豆资源有 限，无法满足市场的需求，对甲醇蛋白的发展十分有利。据专家预测，我国 对甲醇蛋白的市场需求，目前每年约为300-500万吨。单细胞蛋白可以制成"人造肉"，供人们直接食用，还可以作为食品添加 剂，用以补充蛋白质或维生素、矿物质等。由于某些单细胞蛋白具有抗氧化 能力，使食物不容易变质，因而常用于婴儿粉及汤料、作料中。干酵母的含 热量低，常作为减肥食品的添加剂。此外，单细胞蛋白还能提高食品的某些 物理性能，如意大利烘饼中加入活性酵母，可以提高饼的延薄性能。酵母的 浓縮蛋白具有显著的鲜味，已广泛用作食品的增鲜剂。单细胞蛋白作为饲料 蛋白，也在世界范围内得到了广泛应用。世界范围来看，甲醇蛋白的生产发酵时间一般达到160小时左右，发酵温度在30 38'C不等，利用本菌种发酵时间在80 90小时，发酵温度3(TC，实现了温度相对较低、时间较短的高密度发酵。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对甲醇蛋白生产发酵时间长等缺点，筛选出一株具有 工业化前景的毕赤酵母菌株，为甲醇单细胞蛋白的生产奠定基础。本专利技术的另一目的是提供一种利用毕赤酵母菌从工业甲醇生产单细胞蛋 白的方法。本专利技术还有一个目的是提供该菌在词料或食品添加剂方面的应用。本专利技术的目的可以通过以下措施达到本专利技术所述的酵母菌株为巴氏毕赤酵母(P/c/z/a pwto&)，编号为 ME-SCPOl，该菌株己于2008年4月29日保存中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其保藏号为CGMCCNO:2477。尸/c/z/a; wto&ME-SCP01属于子囊菌门、半子囊菌纲、酵母目、酵母科、 酵母属。在YPD培养基上细胞多数呈卵圆形、芽殖；菌落质地均匀，乳白无 光泽，表面湿润、粘稠，易被挑起。菌株ME-SCPOl能在无机盐培养基上正常生长，能以葡萄糖、甘油、甲 醇等作为唯一碳源及能源。当以葡萄糖或甘油作碳源时，菌体中只有l个或 很少几个小的过氧化物酶体，而以甲醇作为碳源时，过氧化物酶体几乎占到 整个细胞体积的80%,醇氧化酶增至细胞总蛋白的35%-40%。菌株ME-SCP01在20 37'C之间均能生长，最适生长温度为27~30°C， 其中在3(TC的生长速率最快。培养基的pH值范围在3.0-6.0之间，菌体生 长及合成蛋白质的最佳pH为5.0-6.0。本专利技术同时提供了一种利用毕赤酵母以工业甲醇为原料生产单细胞蛋白 的工艺。甲醇进入毕赤酵母细胞内的溶酶体，诱导醇氧化酶的表达，醇氧化酶则 将甲醇氧化为甲醛。 一部分甲醛继续氧化为甲酸，最终生成C02释放能量， 另一部分甲醛则通过5磷酸木酮糖循环生成3-磷酸甘油醛，然后进入主代谢 途径，合成菌体。利用巴氏毕赤酵母ME-SCP01生产单细胞蛋白的方法为先将菌株 ME-SCPOl/在初始碳源的条件下迅速繁殖菌体，当初始碳源消耗将尽时， 缓慢流加甲醇进行培养70 100小时，收集菌体，经干燥、粉碎，得到单细 胞蛋白。具体为在少量甘油或葡萄糖作为初始碳源的条件下，迅速繁殖菌体， 当初始碳源消耗将尽时，缓慢流加甲醇，随着菌体对甲醇的利用率的升高， 逐渐提高甲醇流加速率，最高可达到8-10mhh、l"左右，经过80-90小时(优 选)的培养，细胞实现了高密度培养，菌体干重可以达到120-130克/升，粗 蛋白含量达到了50%。通过离心等方法收获菌体，经流化床干燥及粉碎机简 单粉碎后即可用作蛋白饲料；经过深加工，分离提出菌体中的总蛋白，可以 用作饲料或食品添加剂，如蛋白添加剂等。巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是少数几种能以甲醇为唯一碳源及能源 的微生物之一。本专利所述的菌株尸/c/2/a戶加n's ME-SCP01能利用常规的工 业甲醇生产菌体蛋白，与模式毕赤酵母GS115相比，生长速率更快，因此具 有更大的商业前景。生物材料保藏信息毕赤酵母菌，其分类命名为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)ME-SCP01，已于2008年4月29日在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址中国.北京.朝阳区大屯路)保 藏，其保藏号为CGMCCN0.2477。具体实施例方式实施例l:菌株ME-SCP01的分离及培养条件在分析四川宏泰化工有限公司工业废水处理系统的好氧活性污泥中主要 微生物种群时，在牛肉膏-蛋白胨培养基上分离出了多株从属于芽孢杆菌属、 假单胞菌属以及酵母属的微生物。对其中一株毕赤酵母的甲醇利用能力进行 了测试，并以毕赤酵母GS115作为对照。初步试验表明，该毕赤酵母利用甲 醇的速度比菌株GS115更快、耐受甲醇的浓度更高。因此，利用该毕赤酵母 可以进行单细胞蛋白的生产。将该菌株命名为ME-SCPOl。菌株ME-SCPOl的培养及保存采用常规的YEPD复合培养基酵母提取 物、1%，蛋白胨、2%，葡萄糖、2%。制备固体培养基时在灭菌前向液体YEPD 中加入2%的琼脂。菌株ME-SCP01的最佳培养温度为30 °C 。液体培养时，在250 ml的三 角瓶中装液50ml，摇床转速为200rpm。 实施例2:菌株ME-SCPOl的种子培养一级摇床种子 一级液体种子的培养采用YEPD培养基(配方同上)。 首先将菌种ME-SCP01从保存的YEPD斜面接种至装有100 ml液体YEPD 培养基的250ml三角瓶，30 。C摇床培养24-30小时，转速为200rpm。二级种子将一级种子按照10%的接种量转接至装有6升液体培养基的 IO升发酵罐，培养条件通气量l-2vv/m，搅拌速度600-800 rpm，培养时 间24-30小时，培养温度3(TC。培养基选用无机盐培养基，具体配方如下 甘油、40 g， CaS04、 0.9 g， K2S04、 14.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速利用工业甲醇的毕赤酵母菌，其分类命名为巴氏毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＥ－ＳＣＰ０１，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，其保藏号为：ＣＧＭＣＣＮＯ．２４７７。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，胡南，冯孝庭，董永良，何星材，肖爱华，熊世平，范益春，常淑梅，
申请(专利权)人：南京工业大学，四川宏泰生化有限公司，江苏煤化工程研究设计院有限公司，
类型：发明
国别省市：84[]