东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法技术

东北林蛙和卵油的分子鉴别方法，是为了解决对东北林蛙及其产品卵油的鉴定，目前仍主要依据性状特点、显微特征、理化性质等，这些依据由于缺乏明显的形态鉴别特征和特殊的化学成分，实践中对卵油的鉴定仍感到十分困难的技术问题而设计的。该鉴别方法是一种以ＰＣＲ技术为基础，筛选特异引物进行扩增，从而达到对东北林蛙和卵油的分子鉴别。具体实现步骤为：（１）基因组ＤＮＡ提取；（２）基因组ＤＮＡ检测与浓度测定；（３）ＰＣＲ扩增；（４）ＰＣＲ扩增产物鉴别。特点及有益效果：从分子生物学基本理论出发，应用现代分子标记技术对东北林蛙和卵油进行分子鉴别，具有理论基础科学可信，技术手段和实现步骤先进合理，及检测结果可靠等特点。以及所筛选引物特异性强，琼脂糖凝胶电泳特征谱带稳定性高，在实际应用中能够获得可靠而有益的效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物的分子鉴别方法，主要针对东北林蛙动物种及其产 品卵油的分子鉴别方法。
技术介绍
东北林蛙具有重要经济意义和医疗保健价值。雌蛙输卵管干制品入药， 称为林蛙油或哈士蟆油，为名贵的动物药材。该药材鉴定目前仍主要依据性 状特点、显微特征、理化性质等，但由于该药材缺乏明显的形态鉴别特征和 特殊的化学成分，实践中对林蛙卵油的鉴定仍感到十分困难。
技术实现思路
针对东北林蛙和林蛙卵油在生产经营实践中难以从性状特点、显微特征、 理化性质等方面进行鉴定的问题，本专利技术应用分子生物学技术解决林蛙卵油 及其药源动物东北林蛙的分子鉴定，提供了一种以PCR技术为基础，筛选特 异引物进行扩增，从而达到对，具体实现 步骤为(1)基因组DNA提取① 称取组织样品100 ~ 500 mg，剪碎，放入灭菌的1. 5ml的EP管中；② 加入600ju 1 1 xSET液、20y 1蛋白酶K (10mg/ffll)、 25 y 1 SDS，温 度在55。C的条件下，空气浴2小时；③ 加500 nl Tris饱和酚和200 yl TE上下颠倒10分钟；④ 以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；⑤ 加入等体积的酚氯仿异戊醇(24: 23: 1 ),再补加200 |a 1 TE混合10 分钟； 以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；⑦ 加入等体积的氯仿异戊醇(23: 1 )，再补加200 n 1 TE混合10分钟；⑧ 以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；⑨ 加入2倍体积的无水乙醇(-20。C预冷)，水平摇动30次，用枪头挑出 白色DNA沉淀；⑩ 加入700 |i 1 70 %的冷乙醇，以8000转/分钟，离心5分钟，倒掉乙 醇，自然干燥； 加入TE溶液50 100n 1，置于55。C水浴3~4小时； 在4。C下保存。 (2 )基因组DNA检测与浓度测定用紫外分光光度计测定DM浓度根据记录的OD260/28G比值，估测DNA 质量，OD260/280在1. 6~ 1. 8之间，可以满足试验要求；根据记录的OD260 数值及测试液稀释倍数，换算出DNA的浓度。对DNA原液作相应的稀释，以 50ng/iul分装，作为工作液4'C保存使用。 (3 ) PCR扩增采用特异引物(F: 5' - GCC TTT CTA CCG CAA ATA - 3'; R: 5' - AGG TGC TTT TTT TCT GGG -)于PCR仪中进行扩增。 (4)特异扩增产物鉴别扩增产物经1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，IOOV恒压，EB染色；在凝胶图谱分析系统上观察和分析，并记录结果；东北林蛙及卵油基因组DNA在lOOObp 处扩增出特异条带，无性别和个体差异，作为东北林蛙及卯油鉴别的特征谱带。本专利技术的特点及有益效果本专利技术从分子生物学基本理论出发，应用现代分子标记技术对东北林蛙 和卵油进行分子鉴别，具有理论基础科学可信，技术手段和实现步骤先进合 理，以及检测结果可靠等特点。本专利技术中，PCR扩增引物的筛选和琼脂糖凝胶 电泳特征谱带的检测是中心环节，多次反复检测试验证明，所筛选引物特异 性强，琼脂糖凝胶电泳特征谱带(1000bp)稳定性高，在实际应用中能够获 得可靠而有益的效果。附图说明图1林蛙样本特异引物DNA扩增图谱 具体实施例方式，该方法是一种以PCR技术为基础， 筛选特异引物进行扩增，实现对东北林蛙和卵油的分子鉴别，具体实现步骤 为(1)基因组DNA提取① 称取组织样品100 ~ 500 mg,剪石卒，》史入灭菌的1. 5ml的EP管中；② 加入600 pl lxSET液、20yl蛋白酶K (10mg/ml)、 25 n 1 SDS,温 度在55'C的条件下，空气浴2小时；③ 加入S00jal Tris饱和酚和200jal TE上下颠倒10分钟； 以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；⑤加入等体积的酚氯仿异戊醇(24: 23: 1 )，再补加200 ja 1 TE混合10 分钟； 以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；⑦ 加入等体积的氯仿异戊醇(23: 1 ),再补加200 y 1 TE混合10分钟；⑧ 以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水，相下层去掉；⑨ 加入2倍体积的无水乙醇(-20。C预冷)，水平摇动30次，用^T头挑出 白色DNA沉淀；⑩ 加入700ial 70%的冷乙醇，以8000转/分钟，离心5分钟，倒掉乙 醇，自然干燥； 加入TE溶液50 100ili1,置于55。C水浴3 4小时； 在4。C下保存。 (2 )基因组DNA检测与浓度测定用紫外分光光度计测定DNA浓度根据记录的OD260/280比值，估测DNA 质量， 一般0D2 6 0/280在1. 6 ~ 1. 8之间，可以满足试—睑要求；根据记录的0D26 0 数值及测试液稀释倍数，换算出DM的浓度。对DNA原液作相应的稀释，以 50ng/jil分装，作为工作液4。C保存使用，DM原液置于-20。C保存。 (3 ) PCR扩增用引物(F: 5' — GCC TTT CTA CCG CAA ATA - 3'; R: 5' - AGG TGC TTT TTT TCT GGG-3')于PCR仪中进行特异扩增反应； PCR扩增反应体系组成10xPCR buffer为2. 1， 10mmol/LdNTP为2. 0 n 1 ， Primer( F )10pmo1/ p 1为1. 0 i-i 1 ， Primer ( R ) lOpmol/ ju 1为1. 0 n 1, Taq DNA polymerase为0. 2jj 1 (1U), Template为2. 0ja l( 50ng/ p 1 )， Autoclaved， distilled water 为16. 3 m 1。总体积为25ul。 PCR扩增反应程序在94. (TC预变性7min，然后进入如下循环94. O'C变性50s、 56. 9'C复 性lmin、 72. (TC延伸lmin,循环35次，循环结束后72. (TC再延伸lOmin。 (4)特异扩增产物鉴别扩增产物经1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，IOOV恒压，EB染色；在凝胶图 谱分析系统上观察和分析，并记录结果；东北林蛙及卵油基因组DNA在lOOObp 处扩增出特异条带，无性别和个体差异，可以作为东北林蛙及卵油鉴别的特 征谱带。 实施例对采购自吉林长白山地区的东北林蛙和卵油真伪作鉴别对象。 东北林蛙和卵油样本各取3个。具体操作步骤如下 (1)基因组DNA提取① 用电子天平(FA1604N，上海精密科学仪器厂)称取样本组织200mg (东 北林蛙样本取肌肉组织)，用70%酒精清洗，灭菌剪刀剪碎，放入1.5ml的 EP管中，自然风干30 ~ 60分钟使酒精挥发；② 向EP管中加入600jal lxSET液、20 n 1蛋白酶K (10mg/ml )、 25 u 1 SDS,用空气浴振荡器(CHA-S,深圳天南海北有限^^司)55。C下空气浴2小时；③ 向EP管中加入500 |a 1 Tris饱和酚和200 ja 1 TE上下颠倒10分钟；④ 用高速离心机本文档来自技高网...

【技术保护点】
东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法，其特征在于：该方法是一种以ＰＣＲ技术为基础，筛选特异引物进行扩增，实现对东北林蛙和卵油的分子鉴别，具体实现步骤为：　（１）基因组ＤＮＡ提取：　①称取组织样品１００～５００ｍｇ，剪碎，放入灭菌的１． ５ｍｌ的ＥＰ管中；　②加入６００μｌ　１×ＳＥＴ液、浓度为１０ｍｇ／ｍｌ的蛋白酶Ｋ２０μｌ、２５μｌ　ＳＤＳ，温度在５５℃的条件下，空气浴２小时；　③加５００μｌ　Ｔｒｉｓ饱和酚和２００μｌ　ＴＥ上下颠倒１０分钟；　 　④以１００００转／分钟，离心１０分钟，吸上层水相，下层去掉；　⑤加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇＝２４∶２３∶１，再补加２００μｌ　ＴＥ混合１０分钟；　⑥以１００００转／分钟，离心１０分钟，吸上层水相，下层去掉；　⑦加入等 体积的氯仿∶异戊醇＝２３∶１，再补加２００μｌ　ＴＥ混合１０分钟；　⑧以１００００转／分钟，离心１０分钟，吸上层水相，下层去掉；　⑨在－２０℃温度下预冷，加入２倍体积的无水乙醇，水平摇动３０次，用枪头挑出白色ＤＮＡ沉淀；　 　⑩加入７００μｌ　７０％的冷乙醇，以８０００转／分钟，离心５分钟，倒掉乙醇，自然干燥；　＊加入ＴＥ溶液５０～１００μｌ，置于５５℃水浴３～４小时；　＊在４℃下保存。　（２）基因组ＤＮＡ检测与浓度测定　用紫外分光光 度计测定ＤＮＡ浓度：根据记录的ＯＤ２６０／２８０比值，估测ＤＮＡ质量，ＯＤ２６０／２８０在１．６～１．８之间，可以满足试验要求；根据记录的ＯＤ２６０数值及测试液稀释倍数，换算出ＤＮＡ的浓度。对ＤＮＡ原液作相应的稀释，以５０ｎｇ／μｌ分装，作为工作液４℃保存使用。　（３）ＰＣＲ扩增　采用特异引物（Ｆ：５′－ＧＣＣ　ＴＴＴ　ＣＴＡ　ＣＣＧ　ＣＡＡ　ＡＴＡ－３′；Ｒ：５′－ＡＧＧ　ＴＧＣ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＧＧＧ－３′）于ＰＣＲ仪中进行扩增。　 　（４）特异扩增产物鉴别　扩增产物经１．２％琼脂糖凝胶电泳检测，１００Ｖ恒压，ＥＢ染色；在凝胶图谱分析系统上观察和分析，并记录结果；东北林蛙及卵油基因组ＤＮＡ在１０００ｂｐ处扩增出特异条带，无性别和个体差异，作为东北林蛙及卵油鉴别 的特征谱带。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨宝田，
申请(专利权)人：沈阳师范大学，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]