CYP2C9基因第九号外显子单核苷酸多态性的检测方法技术

一种基因工程技术领域的ＣＹＰ２Ｃ９基因第九号外显子单核苷酸多态性的检测方法。方法包括：步骤一，以ＧｅｎＢａｎｋ数据库中ＣＹＰ２Ｃ９基因第九号外显子以及外显子与内含子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，利用引物对来扩增ＣＹＰ２Ｃ９基因的第九号外显子的ＤＮＡ序列，对扩增产物进行分离纯化，得到相应分离核酸；步骤二，对分离核酸的ＣＹＰ２Ｃ９基因第九号外显子的第１７３９－１７４０位核苷酸进行检测，确定其是否存在单核苷酸多态性。本发明专利技术可用于研究我国人群中ＣＹＰ２Ｃ９基因多态性与临床用药安全的关系，为新药研发提供了指导依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因工程
的单核苷酸多态性的检测方法，具体是一种CT尸it^基因第九号外显子单核苷酸多态性的检测方法。
技术介绍
细胞色素氧化酶P450 2C9，即CYP2C9是细胞色素P450的一个成员。CYP2C9 在人类肝微粒体内含量丰富，约占CYP450s总量的2096，仅次于CYP3A4。人类 的6T尸i^基因定位在染色体10q24. 2。迄今为止，己分离出六个CYP2C的cDNAs， 即CYP2C8、 CYP2C9、 CYP2C10、 CYP2C17、 CYP2C18及CYP2C19。 CYP2C9和CYP2C10 仅有2个氨基酸的不同，且二者的催化活性极为相似，故一般常把CYP2C9和 CYP2C10统称为CYP2C9/10或CYP2C9。 CF/^C9含有9个外显子和8个内含子， 全长约5.5kb。在6T/l ("5'-上游2.2kb内含有几个与糖皮质激素效应元件一 致的序列，另外在起始密码子上游57bp和110bp处分别有一个TATA和CMT盒。 在5'调控区至少存在7个SNPs，它们可能影响CKPa^的转录，其中位于 HNF-l(H印atic nuclear factor-1)结合位点的T-1912C参与了基因转录的激活。 另外，第一外显子内的6bp重复也参与了基因表达的调控。若缺失从-155到0 这段序列，基因转录水平会降低至正常状态的1/7-1/8,这意味着可能有重要的 未知调控元件位于该区间。6T/^^编码的酶蛋白分子量为53KDa，含有490个 氨基酸。CYP2C9含有一个能被细胞色素b5识别并对其产生激活作用的位点，即 Arg-Arg-Phe-Ser，经cAMP依赖性激酶进行丝氨酸残基磷酸化修饰后能被细胞 色素b5所识别，进而导致该酶的激活。临床上约有10%的常用药物由CYP2C9 催化代谢，常见的底物有磺胺类、氨基比林(Antipyrin)、双香豆素 (Dicoumarol)、氯霉素(Chloramphenicol)、西米替丁(Cimetidine)、咪唑类抗 真菌药、甲苯磺丁脲(Tolbutamid)等。多数Cr尸it^的单核苷酸突变可以影响基 因的后续转录和表达，进而改变酶的结构和活性，这是造成个体差异的主要原因。鉴于CYP2C9在药物代谢中的作用及活性存在个体差异，因此CF尸iV"基因 的多态性检测是急需解决的技术问题。经对现有技术文献的检索发现，未发现有OPit^基因第九号外显子单核苷 酸多态性(SNP)检测方法的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基因第九号外显子单核苷酸多态性的 检测方法。本专利技术为药物设计提供了基因学理论根据，同时也为基于药物基因组 学理念的新药研发提供了指导依据。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术涉及的一种cr/^^9基因第九号外显子单核苷酸多态性的检测方法，其步骤具体为步骤一，以GenBank数据库中。7^<"基因第九号外显子以及外显子与内含 子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，利用引物对来扩 增6T尸it^基因的第九号外显子的DNA序列，对扩增产物进行分离纯化，得到相 应分离核酸；步骤二，对分离核酸的6T尸itP基因第九号外显子的第1739-1740位核苷酸 进行检测，确定其是否存在单核苷酸多态性，即两个碱基AT的缺失。步骤一中，所述一对等位基因特异性的核酸引物，该引物长度为15bp-50bp， 且特异性地杂交并扩增出含人《7^<"基因第九号外显子的如序列表SEQ ID NO. 1所示序列的第1739-1740位的单核苷酸多态性的扩增产物。步骤一中，所述分离核酸，该核酸具有序列表SEQ ID N0.2所示的序列。步骤一中，所述分离纯化具体为在基因组DNA水平上，利用引物来扩增 每个多态性位点的基因序列和利用纯化试剂盒对扩增产物进行提纯。步骤二中，所述检测，具体包括以下方法DNA测序法、杂交测序法、酶促 错配切割法、异源双链分析法、点杂交法、寡核苷酸阵列法、微测序法、Taqman 技术、分子信标法、变性高效液相色谱法。用于本专利技术的测试样品中抽提出的DNA或mRNA。对于OT^CP基因的第九号 外显子活性而言，可以是任何含有CJ7^"基因的第九号外显子的样品。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的效果本专利技术是一项原创性的专利技术。本专利技术的内容涉及一种分离出的或纯化的cr尸i^p基因的第九号外显子多态性位点的基因序列，所说的"分离出的或纯化的"是指在基因组DNA水平上，利用引物对来扩增多态性位点的基因序列和利用纯化试剂盒对扩增产物进行提纯。通过对所取样品cr尸i^p基因测序结果，在两个地区中发现了 i个样品含有 cr尸it^基因的第九号外显子snp和2个样品含有6t尸iV"基因的第九号外显子 SNP。本专利技术为研究我国人群中6t尸^"基因多态性与临床用药安全的关系奠定了基础，为药物设计和临床用药个体化提供了基因学理论根据，同时也为基于药 物基因组学理念的新药研发提供指导依据。 具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术 而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条 件。实施例步骤一，核酸的分离和测序 引物设计采用Primer 5. 0软件，以GenBank数据库CF/^C9基因(NM—000771)，第 九号外显子以及外显子与内含子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性 的核酸引物，由Invitrogen公司合成。引物信息扩增Cr尸iV"基因的第九号外显子SNP位点的DNA序列引物信息 正向引物 5，-CTCTGTGCCGCCCTTCTAC-3'; 反向引物 5'墨TACCCTCTTCCTCTTTGTCC隱3，。PCR扩增条件体系各项试剂除DNA外均由Bio-Asia公司提供， 反应体系总体积为15W，其中各反应试剂的用量表述如下 ddH20 10.10 X Buffer 1.5Ml，其中聚合反应缓冲液包含KC1 Tris-HC1溶液DMSO 0. 2mM d證1.10pM正反向引物各0. 6^1 5U Taq 0.lOng DNA 0. 10ng 。 PCR反应条件94°C 3mins; 14X (94。C 30 seconds; 64°C 30 seconds, -0. 5°C/CYCLE; 72 。C lmin;); 30X (94°C 30 seconds; 57。C 30 seconds; 72 °C lmin;); 72°C 10mins。测序反应均作正反向，条件如下扩增产物酶纯化法PCR产物2W加入2W纯化酶系，其中纯化酶系内含 SAP(Shrimp alkaline phosphatase,碱性磷酸酶)0. 15u/ul和Exo-nuclease I(核酸外切酶I) 0. 75u/ul， 37。C 30mins,85。C 20mins， 4°C保存备用。须!l序采用ABI公司的Prism BigDy本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＣＹＰ２Ｃ９基因第九号外显子单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于包括如下步骤：　步骤一，以ＧｅｎＢａｎｋ数据库中ＣＹＰ２Ｃ９基因第九号外显子以及外显子与内含子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，利用引物对来扩增ＣＹ Ｐ２Ｃ９基因的第九号外显子的ＤＮＡ序列，对扩增产物进行分离纯化，得到相应分离核酸；　步骤二，对分离核酸的ＣＹＰ２Ｃ９基因第九号外显子的第１７３９－１７４０位核苷酸进行检测，确定其是否存在单核苷酸多态性，即两个碱基ＡＴ的缺失。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：秦胜营，贺林，熊玉宇，王鸣，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]