本发明专利技术公开了一种鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的引物序列及其方法，包括两组引物，第一组引物的正向引物具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所述的碱基序列。本发明专利技术引物序列特异性高，能够用于快速鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰 孢菌的引物序列及其方法。
技术介绍
赤霉病是小麦生产上重要的一种流行性病害。该病害主要分布在长江 中下游冬麦区和东北春麦区，长江上游和华南冬麦区也常发生。该病害发生后一般减产10-20%,严重时达80-90%。它的危害严重影响小麦的产量 和质量，同时病菌产生的一系列真菌毒素可引起人畜中毒。在我国,亚洲镰孑包菌(Fwran'wm)和禾谷镰孑包菌(Fwsan'wm graw/"earaw )是小麦赤霉病的主要致病菌。亚洲镰孢菌主要分布在我国 南方地区，而禾谷镰孢菌主要分布在北方地区。这两个小种非常相近，根 据多个基因序列差异对亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的鉴定较麻烦，利用已报 道引物对GzTri7/fl和GzTri7/rl进行PCR扩增(Zhang et al., 2007, Mycological Research, 967-975 ),不能给出扩增产物或得到161-bp产物为 亚洲镰孢菌，得到172 326-bp产物为禾谷镰孢菌，该对引物无法区分亚 洲镰孢菌和其它病菌真菌。因此，需要重新建立一套新的体系，即能快速 检测，又能准确鉴定这两个不同的小种。该体系的建立将对两个小种的快 速检测、分布研究及小麦赤霉病的防治具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了 一种鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的引物序列，该引物 特异性高，利用该引物序列能快速、准确地鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌。一种鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的引物序列，包括两组引物，第一 组引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO: l所述的碱基序列，第一组 引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO: 2所述的碱基序列；第二组引 物的正向引物具有序列表中SEQIDNO: 3所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO: 4所述的碱基序列。已有研究可知，亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌在遗传背景上存在较大差 异，通过对3个亚洲镰孢菌菌抹(Fal, Fa2, Fa3 )和3个禾谷镰孢菌菌 抹(Fgl, Fg2, Fg3)的cy/ 5L4基因测序发现，如图1所示，亚洲镰孢菌 和禾谷镰孢菌的菌株间共存在69处核苷酸差异，其中16个核苦酸引起氨 基酸变化。根据两个菌系c少/ 5/J基因序列的差异，我们设计了上述两组引物。 第一组引物的正向引物3，末端碱基T与亚洲镰孢菌菌株的特异碱基T配 对，第一组引物的反向引物3，末端碱基G和倒数第二个碱基T分别与亚 洲镰孢菌菌林特异碱基CA配对。同理，第二组引物的正向引物3，末端碱 基T与禾谷镰孢菌(菌抹的特异碱基T配对，第二组引物的反向引物3， 末端碱基A和倒数第二个碱基C分别与禾谷镰孢菌菌抹特异碱基TG配 对。利用第一组引物对亚洲镰孢菌菌抹的DNA进行扩增可以得到292-bp 的片断，利用第二组引物对禾谷镰孢菌菌抹的DNA进行扩增可以得到 352-bp的片断，利用任何一组引物对其它真菌的DNA进行扩增，不能扩 增出任何产物。本专利技术还提供一种应用上述引物鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的方 法，包括以下步骤a、 提耳又待;险测菌的DNA;b、 以待检测菌的DNA为模板，使用第一组引物和第二组引物进行 PCR扩增；c、 PCR产物经凝胶电泳后用EB进行显色，当凝胶上显现292-bp DNA 条带时，说明待检测菌为亚洲镰孢菌。当凝胶上显现352-bp DNA条带时， 说明待检测菌为禾谷镰孢菌。当凝胶上未显现条带时，则说明待检测菌 为其它病菌真菌。本专利技术提供的两组引物和方法能快速鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌， 检测引物具有很高特异性，且整个PCR和电泳过程仅需2 h。因此，本 专利技术的引物和检测方法可用来快速、准确、全面检测引起小麦赤霉病的 主要病原菌。附图说明图1为本专利技术引物的序列图2为引物特异性检测中各菌抹DNA扩增后的凝胶电泳图； 图3为检测不同地方子囊壳DNA扩增后的凝胶电泳图。具体实施方式 所选用的菌林尖孑包錄孑包菌(Fusw/顯o平/ 。r應)、燕麦錄孑包菌(F flve"acewm )、锐 顶镰孢菌(F )、半净果镰孢菌(F^附/fedww)、串J朱镰孑包菌swZ)g/W/"(3ra )、黄色镰孑包菌(F cw/won潔)以及5个亚洲镰孑包菌(Fwsan'ww as她c訓)菌抹(Fal,, Fa2, Fa3， Fa4, Fa5 )和5个禾谷嫌孑包菌(Fw5W7'謂 gramz'wear膽)菌抹(Fgl, Fg2, Fg3， Fg4， Fg5 )。上述菌林均为常见的植物病原真菌，是本专利技术所需的试验材料，对菌 抹没有特异性要求，可以通过常规的分离纯化方法得到。提取DNA用接种针从PDA平板上刮取菌丝(100 mg )，置于1.5-mL Eppendorf 管中，加500 DNA提取裂解液(200 mM Tris-HCl， 50 mM EDTA， 20 mM NaCl, l%SDS,pH 8.0)，用电钻驱动玻棒充分研磨，振荡混匀，室温静置 10min; 13200 r/min 4。C ,离心5min;取上清液约400 pL于新的1.5-mL Eppendorf管中，力。750 )xL无水乙醇，混和混勻，13200 r/min 4°C ，离心5 min,弃上清；沉淀用70%乙醇洗涤，室温放置干燥5-10 min,溶于30 (iL 无菌水中，-201:保存备用。上述的6种真菌以及待检测的亚洲镰孢菌菌林和禾谷镰孢菌菌抹的 DNA均采用上述方法提取。引物合成如图1所示，根据3个亚洲镰孢菌菌抹和3个禾谷镰孢菌菌抹中 c;^5L4基因序列，设计了 2对引物Fa-F/Fa-R和Fg-F/Fg-R。<table>table see original document page 6</column></row><table>上述序列可以通过常^5L方法合成，也可以委托专业生物试剂公司合 成，本专利技术的引物由上海博彩合成。引物特异性验证以上述提取的8种真菌的DNA为模板，用Fa-F/Fa-R和Fa-F/Fa-R两 组S1物进行PCR反应，每次反应均包含一个阴性对照(用无菌水代替DNA 模板)。25 反应体系1 (iL DNA模板(约0.4 ng )，引物各0.2 pmol I — 1, dNTP0.2pmoir',MgCl2 2mmoll:lx緩冲液(北京东胜公司生产)，聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25^L。反应条件为95。C预变性3min, 94。C变性30s， 55。C退火30s, 72°C 延伸30s,进行35个循环，最后72。C延伸5min。 PCR产物用1.5。/。的琼脂 糖在1 xTAE緩沖液中电泳后，用EB显色拍照。如图3所示，5个禾谷镰孢菌菌株(Fgl， Fg2， Fg3, Fg4, Fg5)均能 扩增到352-bp的条带，5个亚洲镰孢菌菌林(Fal， Fa2， Fa3， Fa4, Fa5) 均能扩增到292-bp的条带，其它病原真菌都没有扩增到任何条带。由此可 见，上述两组引物的特异性很高，适合鉴定亚洲镰孢菌菌抹和禾谷镰孢菌。检测不同地区亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的分布/人江苏省海安市A (大爿/H真)、江苏省海安本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的引物序列，其特征在于：包括两组引物，第一组引物的正向引物具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有 序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所述的碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马忠华，尹燕妮，刘馨，蒋金花，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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