本发明专利技术涉及一种用于检测烟草根黑腐病菌的引物、探针及实时荧光ＰＣＲ试剂盒，所述的引物包括正向引物Ｔｂ１和反向引物Ｔｂ２，其碱基序列分别是：Ｔｂ１：５’－ＡＣＣ ＡＴＡ ＴＧＴ ＧＡＡＣＧＴ ＡＣＣ ＴＴＴ ＴＣＴ－３’，Ｔｂ２：５’－ＡＧＴ ＴＴＡ ＴＡＡ ＡＴＧ ＣＴＡ ＣＣＧ ＧＣＡ ＧＡＡ－３’。所述的探针的碱基序列是在５’－ＣＣＣ ＧＡＧ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＣＣＡ ＡＡＧ ＣＡ－３’两端向上游移位２个碱基或下游移位３个碱基区域内的任意一条核苷酸序列，在该条核苷酸序列上，荧光报告基团标记在５’端，荧光淬灭基团标记在３’端，以构成荧光标记探针，并用上述的引物和探针制备成相应的试剂盒。本发明专利技术能在田间病土中快速、准确地检测烟草根黑腐病菌，从而为及时采取措施切断病害的侵染源提供准确依据，也可以快速、准确地检测植株上的病害。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种适合于农业生产、植物保护等部门使用的生物工程技术，特 别是 一 种用于检测烟草生产中的土传病害——烟草根黑腐病病原菌 w'o/^is》ssicWs的引物、探针及实时荧光PCR试剂盒。
技术介绍
烟草根黑腐病是烟草上的重要病害之一，它遍布世界主要产烟区，在美国、加拿大、 曰本等国曾使烟草生产遭受严重损失，我国主产烟区也均有发生。尤其近年来，此病在一 些烟区蔓延，在我国云南、贵州、湖北等省发生较重，严重地块发病率可达30%以上。山 东、河南、安徽、吉林、福建等省也有发生，近年有加重危害的趋势。目前对于植物病原真菌的检测方法主要有免疫学技术，分子标记技术和常规PCR技术， 但这些技术只能确定病原微生物的有无，却不能对病原真菌的分生孢子及厚亘孢子数目进 行准确的定量。而传统的植物病原真菌检测定量方法是选择性培养基培养计数法，但选择 性培养基培养计数周期长，耗费人力，而且需要操作者具有丰富的形态学知识，因而限制 了选择性培养基培养计数法的应用。继常规PCR检测技术之后，新兴的实时荧光定量PCR技术凭借其对初始模板 量准确定量、灵敏度高、特异性强、简便迅速等优点，已经成为国内外分子生物 学研究中的主流技术，同样也在植物病原体的检测和诊断中得到了广泛使用。近 年来国内外陆续开始将实时荧光PCR技术应用于植物病害诊断检测。实时定量荧光PCR是利用荧光信号伴随着PCR产物的增加而增强的原理，在PCR扩增 过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。根据荧光信号基线的平均值和平均 标准差，在99.7%的置信度时计算出大于平均值的荧光值即阈值，然后收集荧光信号增强 到预定阈值时的PCR循环次数(即Ct值)。该参数和PCR反应体系中起始DNA模板量的对 数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度稀释标准品的Ct值绘制成标准曲线，再根据检 测样品的Ct值就可以准确地测定耙标病原菌的起始模板拷贝数。实时荧光PCR根据其产生 荧光的原理分为使用探针和不使用探针的两类方法。由于探针与待检测病原菌DNA序列有 很高的特异性，而且可以有效避免常规PCR的假阳性问题，所以目前使用较为普遍的是荧 光标记探针法。实时荧光PCR检测方法用于植物病原菌的检测，在国内外都还是刚刚起步。目前，在烟草根黑腐病菌的实时荧光PCR检测中，以5，-ACC ATA TGT GAA CGT ACC TTT TCT -3，和5，- AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA -3'为引物、以5，- CCC GAG AGG CAC CTGCCAAAGCA -3'序列为探针制备成相应的实时荧光PCR试剂盒，尚无相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一就是提供一种用于检测烟草根黑腐病菌的引物，它可以在 PCR检测过程中，定性检测烟草根黑腐病菌，而且特异性强。本专利技术所提供用于检测烟草根黑腐病菌的引物包括正向引物Tbl和反向引物Tb2组成 的引物对，所述正向引物Tbl的核苷酸序列见序列表中的序列1所示，Tbl: 5'-ACCATATGT GAA CGT ACC TTT TCT -3，；所述反向引物Tb2核苷酸序列见序列表中的序列2所示，Tb2: 5，- AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA -3，。申请人是经过长期大量的实验，从众多用于检测烟草根黑腐病菌的PCR引物中筛选 出上述的由正向引物Tbl和反向引物Tb2组成的引物，其扩增片段大小为76 bp。该引物 的特点是对烟草根黑腐病菌具有高度的保守性，与其它近缘生物种之间不具有显著的同源 性，用该引物进行PCR扩增，实现烟草根黑腐病菌的准确定性检测，且特异性强。本专利技术的目的之二就是提供一种用于检测烟草根黑腐病菌的探针，它可以在实时 荧光PCR检测过程中，定量检测烟草根黑腐病菌，显著地提高检测灵敏度。该探针 的碱基序列是在5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，两端向上移位2个碱基或下游 移位3个碱基区域内的任意一条核苷酸序列，所述探针一端连接有荧光淬灭基团，另一端 连接有荧光报告基团。所述探针荧光报告基团标记在5'端，荧光淬灭基团标记在3'端，构成荧光标记探针。所述探针是在5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3'向上游移位2个碱基的核苷 酸序列5，- GCC CCG AGA GGC ACC TGC CM AGC A -3,，见序列表中的序列4所示。所述探针的核苷酸序列是序列表中的序列3所示的序列5'- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，。所述探针是在5，_ CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，向下游移位3个碱基的核苷 酸序列5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CAG CT -3'，见序列表中的序列5所示。本专利技术的目的之三就是提供一种利用目的一中的引物和目的二中的探针制成 的检测烟草根黑腐病菌的试剂盒，可以在实时荧光PCR检测过程中，快速、准确 地定量检测土壤中和植株上的烟草根黑腐病菌，而且稳定可靠、灵敏度高。所述试 剂盒还包括待测样品提取试剂、定量标准品、实时荧光PCR反应液和检测用品，所述实时荧光PCR反应液包括有如下的组份及其相对应的终浓度PCR缓冲液10%; MgCl2: 2.6mmol/L; dNTPs: 0.2腿ol/L; Taq DNA聚合酶:1 U/20 PL;正向引物Tbl: 0.4 Pmol/L; 反向引物Tb2: 0.4 tool/L;荧光标记探针0.4 Mmol/L;采用无菌超纯水调整终浓度。根据实际情况，在实时荧光PCR反应液中各组份采用的是PCR缓冲液是10xPCR缓 冲液；MgCl2的初浓度是25隱ol/L; dNTPs的初浓度是10醒ol/L; Taq DNA聚合酶的初浓 度是正向引物Tbl的初浓度是lOWnol/L;反向引物Tb2的初浓度是10 Mmol/L; 荧光标记探针的初浓度是5 Mmol/L; PCR缓冲液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向 引物Tbl、反向引物Tb2、荧光标记探针的体积比是20:21:4:4:8:8:16。该荧光定量PCR 扩增体系具有很高的灵敏度，检测目标菌DNA的量达到IOO fg/化。在实时荧光PCR反应液中，各组份采用的是PCR缓冲液是10xPCR缓冲液；MgCl2的 初浓度是25 mmol/L; dNTPs的初浓度是2 mmol/L; Taq DNA聚合酶的初浓度是1 U/pL; 正向引物Tbl的初浓度是5刚ol/L;反向引物Tb2的初浓度是5 Wnol/L;荧光标记探针的 初浓度是5 Wnol/L; PCR缓冲液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物Tbl、反向引 物Tb2、荧光标记探针的体积比是20:21:20:10:16:16:16。该荧光定量PCR扩增体系具 有很高的灵敏度，检测目标菌DNA的量达到IOO fg/A。采用本专利技术中的试剂盒， 一方面，在待测样品预处理过程中，待测样品提取试剂可以 直接提取土壤样品中的烟草根黑腐病菌DNA用作PCR扩增模板，节约了本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测烟草根黑腐病菌的引物，它包括正向引物Ｔｂ１和反向引物Ｔｂ２组成的引物对，所述正向引物Ｔｂ１的核苷酸序列见序列表中的序列１所示，Ｔｂ１：５’－ＡＣＣ ＡＴＡ ＴＧＴ ＧＡＡ ＣＧＴ ＡＣＣ ＴＴＴ ＴＣＴ－３’；所述 反向引物Ｔｂ２核苷酸序列见序列表中的序列２所示，Ｔｂ２：５’－ＡＧＴ ＴＴＡ ＴＡＡ ＡＴＧ ＣＴＡ ＣＣＧ ＧＣＡ ＧＡＡ－３’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊丽，康振辉，刘映红，李常军，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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