本发明专利技术涉及检测新城疫病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法，尤指一组用以检测各亚型的新城疫病毒的特异性核苷酸序列、含有这些序列的试剂盒、以及用该组序列与试剂盒检测新城疫病毒的方法，属于检验检疫领域。一组用于检测各型新城疫病毒的核苷酸序列，具有序列表ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－Ｎｏ．４所示的碱基序列。本发明专利技术的有益效果为：快速、敏感、特异、灵敏、操作简单；试剂盒给检测者提供了质量优异的试剂及优化的操作程序，经过简单的培训，检测者就可胜任该项工作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，尤指一组用以检测各亚型的新城疫病毒的特异性核苷酸序列、含有这些序列的试剂盒、以及用该组序列与试剂盒检测中强毒力新城疫病毒的方法，属于检验检疫领域。
技术介绍
新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的一种急性、败血性、高度接触性传染病，传播迅速，发病率和死亡率高，有时高达100％，一旦爆发，会给养鸡业造成不可估量的经济损失。国际兽医卫生组织将其列为A类传染病，我国也将其列为一类检疫对象。国家质检总局在2001年下发文件，要求对禽肉出口企业进行每两个月一次的定期监测，该规定要求用鸡胚病毒分离方法。鸡胚病毒分离是一种敏感、特异的方法，但是耗时长，约需3周左右，操作烦琐，只能起到监测作用，不能作快速检测用，不利于快速通关和控制禽肉携带病毒。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测中强毒力新城疫病毒的核苷酸序列。本专利技术的另一个目的是提供一种操作简单、结果准确的用与检测中强毒力新城疫病毒的试剂盒。本专利技术的第三各目的是提供一种快捷、准确、方便的检测中强毒力新城疫病毒的方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案检测新城疫病毒的特异核苷酸序列，如下1)上游引物5’ATGGCAGGCCYCTTGCRGCTG 3’2)下游引物5’CCGAGGCTGCTGTTATYTGTGC 3’其中Y代表嘧啶，此处为T或C；R代表嘌呤，此处为A或G。3)探针序列FAM-AAGCGTTTCTGTCTCCTTCCTCCG-TAMRA4)探针序列FAM-AAACGTTTCTGTCTCCTTCCTCCGG-TAMRA新城疫病毒(NDV)基因组为单股不分节RNA，编码6种病毒结构蛋白，其中融和蛋白(F)和血凝素—神经氨酸酶(HN)构成囊膜外表面的纤突，是NDV的功能型糖蛋白，在致病和免疫应答过程中起重要作用。由于新城疫弱毒苗的广泛使用，本方法要求仅检出强毒和中等毒力毒株，而对于弱毒苗不得检出。研究表明新城疫病毒毒力强弱与F蛋白裂解位点区的氨基酸组成密切相关，所以本试剂盒选择新城疫病毒F基因(合成F蛋白)作为靶区域。选择能够反应裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针。引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。检测新城疫病毒的试剂盒，由以下组成成分构成1)裂解液自INVITROGEN公司购买，货号102962)RT-PCR反应液表1 3)RT-PCR酶自安发玛西亚公司公司购买，货号27-9259-01含量12颗4)Taq酶自上海普洛麦格公司购买，5U/ul5)DEPC水自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，电阻率≥18.0MΩ.cm6)阴性对照灭活尿囊液7)阳性对照体外转录的RNA一种新城疫病毒的检验方法，使用新城疫病毒通用引物和探针，灭活尿囊液为阴性对照，对样本进行RT-PCR反应，并判断结果，其中(一)RT-PCR反应的循环条件为42℃30min；92℃3min；92℃10sec，45℃30sec 72℃1min 5个循环 92℃10sec，60℃30sec 40个循环，60℃时设置收集荧光。(二)结果判定标准(1)阴性对照的检测结果为阴性；阳性对照的Ct值应小于等于28.0；否则，此次实验视为无效；(2)Ct值无数值的样本为阴性样本；Ct值≤30.0的样本为阳性；(3)Ct值大于30.0的样本建议重做重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。本专利技术的有益效果为1)快速从样品处理到出结果仅需4小时左右；2)敏感检测组织脏器和拭子的灵敏度与鸡胚病毒分离基本一致；3)特异与常见禽类其他病毒不发生交叉反应，而且不仅采用了特异性的引物，还采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于传统PCR方法，大大杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果；4)灵敏由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统的PCR方法灵敏度高100～1000倍。对于新城疫病毒尿囊液，稀释至10-7仍可检出，接近鸡胚病毒分离；5)操作简单试剂盒给检测者提供了质量优异的试剂及优化的操作程序，经过简单的培训，检测者就可胜任该项工作。下面结合较佳实施例对本专利技术作进一步说明，可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术，凡依照本专利技术的内容所做的任何本领域的等同替换均属于本专利技术的保护范围之内。具体实施例方式实施例1.筛选通用引物和探针序列一.材料该试验涉及的毒种由北京出入境检验检疫局分离保存，具体如下BJ1NDV标准强毒F48E9BJ2NDV野毒 从山东某鸡场发病鸡分离。BJ3NDV野毒 从山东某鸡场发病鸡分离。BJ4NDV野毒 从某肉鸡场发病鸡群分离。BJ5NDV野毒 从内蒙古某发病鸡场分离。BJ6NDV野毒 从2002年国际信鸽大赛参赛死亡信鸽分离。BJ7NDV野毒 从美国进口发病信鸽分离。BJ8NDV疫苗毒Lasota 购自北京生药厂。BJ9NDV IV系苗 购自北京生药厂。BJ10NDV I系苗 购自北京生药厂。BJ11NDV II系苗 购自北京生药厂。二.方法(一)设计合成引物和探针序列新城疫病毒毒力强弱与F蛋白裂解位点区的氨基酸组成密切相关，所以本试剂盒选择新城疫病毒F基因(合成F蛋白)作为靶区域。选择能够反应裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针。引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。引物和探针从不同厂家合成，如上海生工、大连宝生物、国外公司如GIBCO/BRL、IDT等等，要求PAGE纯或HPLC纯，到货时同时提供厂家对该产品的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱。收到引物后做HPLC分析，应该得到单吸收峰图谱、用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间，则视为合格引物。(二)筛选和配对1.通过引物、探针的筛选实验将上述上游引物和下游引物结合探针位置进行配对，PCR反应体系如表2所示表2 PCR反应体系 RT-PCR beads为Amersham Pharmacia Biotech Inc的Ready-To-GoTM RT-PCR Beads(Cat.No.27-9259-01)2.PCR循环参数如下42℃30min；92℃3min；92℃10sec，45℃30sec 72℃1min 5个循环92℃10sec，60℃30sec 40个循环，60℃时设置收集荧光； 3.采用上述条件对新城疫病毒的毒株尿囊液105倍稀释提取RNA，选取合适的引物搭配进行扩增，同时对阳性模板(按如下方法获得用新城疫病毒尿囊液，PBS稀释10-1至10-9，采用异硫氰酸胍—酚—氯仿一步法提取RNA备用。)10-4、10-5、10-6、10-7、10-8进行扩增，得到效率和升幅较高的引物及与之配对的探针序列。三.结果1)上游引物5’本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组用于检测各型新城疫病毒的核苷酸序列，具有序列表ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－Ｎｏ．４所示的碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏传忠，张鹤晓，赖平安，杨伟，高志强，张利锋，刘环，刘继红，郭晋优，李宁，谷强，汪琳，吴丹，段生涛，张向东，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，深圳市匹基生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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