基于转录组测序开发的牡丹EST‑SSR引物及其开发方法技术

本发明专利技术公开了基于转录组测序开发的牡丹EST‑SSR引物及其开发方法。本发明专利技术所提供的牡丹的成套EST‑SSR引物，由A和B组成，所述A为Primer 1，所述B为Primer 2至Primer 6这6种引物对中的6种引物对、5种引物对、4种引物对、3种引物对、2种引物对或1种引物对；Primer 1至Primer 6的序列分别如SEQ ID No.1至SEQ ID No.12所示。本发明专利技术为牡丹遗传图谱构建、牡丹种质鉴定、牡丹育种、牡丹遗传多样性分析、牡丹亲缘关系分析和牡丹分子标记辅助育种提供了技术支持。

Transcriptome sequencing developed SSR primers and EST peony based development method

The invention discloses a transcriptome sequencing developed EST SSR primers and peony based development method. Primer SSR complete EST provided by the invention of the peony, composed of A and B, the A Primer 1, the B Primer Primer 2 to 6 of the 6 primers of 6 primers, of 5 primer pairs, 4 primer pairs, 3 primer pairs 2 primer pairs or 1 primer pairs; Primer 1 to Primer 6 sequence respectively such as SEQ ID No.1 to SEQ ID No.12 shown. The invention provides technical support for peony genetic map construction, peony germplasm identification, peony breeding, peony genetic diversity analysis, peony relationship analysis and peony molecular marker assisted breeding.

【技术实现步骤摘要】
基于转录组测序开发的牡丹EST-SSR引物及其开发方法
本专利技术涉及生物
中基于转录组测序开发的牡丹EST-SSR引物及其开发方法。
技术介绍
牡丹是芍药科芍药属牡丹组的植物，目前已确认的牡丹野生种有大花黄牡丹(Paeonialudlowii)(HongDY,1997.Paeonia(Paeoniaceae)inXizang(Tibet).Novon,7:156–161)、卵叶牡丹(Paeoniaqiui)(裴颜龙、洪德元.卵叶牡丹-芍药属一新种.植物分类学报33(1)：91-93(1995))、紫斑牡丹(Paeoniarockii)(洪涛,张家勋,李家珏,赵文忠,李明瑞.中国野生牡丹研究(一)芍药属牡丹组新分类群[J].植物研究，1992，12(3):223-234)、杨山牡丹(Paeoniaostii)(洪涛,张家勋,李家珏,赵文忠,李明瑞.中国野生牡丹研究(一)芍药属牡丹组新分类群[J].植物研究，1992，12(3):223-234)、四川牡丹(Paeoniadecomposita)(HongDe-yuan,PanKai-yuandPeiYan-long,1996.TheIdentityofPaeoniadecompositaHand.-Mazz.Taxon,45(1):67-69)、保氏牡丹(Paeoniapotanini)(方文培.中国芍药属的研究[J].植物分类学报.1958,7(4):305)、紫牡丹(Paeoniadelavayi)(方文培.中国芍药属的研究[J].植物分类学报.1958,7(4):303)、黄牡丹(Paeonialutea)(方文培.中国芍药属的研究[J].植物分类学报.1958,7(4):303)、稷山牡丹(Paeoniajishanensis)(洪涛,张家勋,李家珏,赵文忠,李明瑞.中国野生牡丹研究(一)芍药属牡丹组新分类群[J].植物研究，1992，12(3):223-234)。分子标记已经成为作物遗传改良和分子辅助育种研究和应用的重要部分。因此，开发大量的分子标记对于牡丹品种改良和分子辅助育种研究是十分必要的。简单重复序列(SSR)广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，因其重复次数不同和重复程度不同而呈现高度的多态性。相对于AFLP、RAPD等分子标记，SSR标记具有多态性高、共显性遗传、重复性好等特点，被认为是目前进行遗传多样性分析和遗传图谱构建的首选分子标记。随着二代测序技术的不断发展和广泛应用，通过转录组序列能够获得大量EST-SSR(基于表达序列标签开发微卫星的一种新型分子标记)。EST-SSR标记反映的是转录区的差异，其多态性可能与基因功能直接相关。为了有效地开发利用牡丹的资源优势，需要建立牡丹的EST-SSR分子标记技术体系，为牡丹的种质鉴定、资源保护、杂交育种提供科学的理论依据。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题提供多态性高的牡丹EST-SSR引物并提供基于转录组测序开发的牡丹SSR引物的方法。为了解决以上技术问题，本专利技术提供了牡丹的成套EST-SSR引物。本专利技术所提供的牡丹的成套EST-SSR引物，由A和B组成，所述A为Primer1，所述B为Primer2至Primer6这6种引物对中6种引物对、5种引物对、4种引物对、3种引物对、2种引物对或1种引物对；所述Primer1由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的两条单链DNA组成；所述Primer2由SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的两条单链DNA组成；所述Primer3由SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的两条单链DNA组成；所述Primer4由SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示的两条单链DNA组成；所述Primer5由SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示的两条单链DNA组成；所述Primer6由SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示的两条单链DNA组成。为了解决以上技术问题，本专利技术提供了牡丹的EST-SSR引物。本专利技术所提供的牡丹的EST-SSR引物，是上述Primer1至Primer6中的任一种。本专利技术还提供了上述牡丹的成套EST-SSR引物的下述A1-A6中的任一种用途：A1、所述成套EST-SSR引物在构建牡丹遗传图谱中的应用；A2、所述成套EST-SSR引物在牡丹种质鉴定中的应用；A3、所述成套EST-SSR引物在牡丹育种中的应用；A4、所述成套EST-SSR引物在牡丹遗传多样性分析中的应用；A5、所述成套EST-SSR引物在牡丹亲缘关系分析中的应用；A6、所述成套EST-SSR引物在牡丹分子标记辅助育种中的应用。本专利技术还提供了上述牡丹的EST-SSR引物下述B1-B6中的任一种用途：B1、所述EST-SSR引物在构建牡丹遗传图谱中的应用；B2、所述EST-SSR引物在牡丹种质鉴定中的应用；B3、所述EST-SSR引物在牡丹育种中的应用；B4、所述EST-SSR引物在牡丹遗传多样性分析中的应用；B5、所述EST-SSR引物在牡丹亲缘关系分析中的应用；B6、所述EST-SSR引物在牡丹分子标记辅助育种中的应用。本专利技术还提供了获取牡丹EST-SSR分子标记的方法。本专利技术所提供的获取牡丹EST-SSR分子标记的方法，包括：1)以牡丹的基因组DNA为模板，用上述牡丹的成套EST-SSR引物或上述牡丹的EST-SSR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；2)将1)中得到的所述PCR扩增产物进行电泳，得到牡丹EST-SSR分子标记。上述方法中，所述PCR扩增采用的引物退火条件可为55-60℃(如59-60℃)，30s。上述方法中，所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序可为：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55-60℃(如59-60℃)退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。上文中，所述牡丹可为下述9种牡丹野生种中的9种、8种、7种、6种、5种、4种、3种、2种或1种：大花黄牡丹(Paeonialudlowii)、卵叶牡丹(Paeoniaqiui)、紫斑牡丹(Paeoniarockii)、杨山牡丹(Paeoniaostii)、四川牡丹(Paeoniadecomposita)、保氏牡丹(Paeoniapotanini)、紫牡丹(Paeoniadelavayi)、黄牡丹(Paeonialutea)和稷山牡丹(Paeoniajishanensis)。本专利技术还提供了基于转录组测序开发牡丹EST-SSR引物的方法，包括：1)构建牡丹转录组文库并测序，获得牡丹转录组EST序列；2)采用软件MISA1.0对EST序列进行SSR位点的筛选：获得牡丹转录组EST序列后先进行去冗余，然后从http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/下载misa.pl程序以识别EST序列中的SSR；参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复单元数目分别不少于12、6、5、5、4、4个，两个SSR序列间隔最小值为100，即序列间隔100bp以上的计为两个SSR位点；3)采用软件Primer3进行EST-SSR引物的设计：使用软件primer3批量设计ES本文档来自技高网...

【技术保护点】
牡丹的成套EST‑SSR引物，由A和B组成，所述A为Primer 1，所述B为Primer 2至Primer 6这6种引物对中的6种引物对、5种引物对、4种引物对、3种引物对、2种引物对或1种引物对；所述Primer 1由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；所述Primer 2由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成；所述Primer 3由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成；所述Primer 4由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成；所述Primer 5由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成；所述Primer 6由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA组成。

【技术特征摘要】
1.牡丹的成套EST-SSR引物，由A和B组成，所述A为Primer1，所述B为Primer2至Primer6这6种引物对中的6种引物对、5种引物对、4种引物对、3种引物对、2种引物对或1种引物对；所述Primer1由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的两条单链DNA组成；所述Primer2由SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的两条单链DNA组成；所述Primer3由SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的两条单链DNA组成；所述Primer4由SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示的两条单链DNA组成；所述Primer5由SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示的两条单链DNA组成；所述Primer6由SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示的两条单链DNA组成。2.牡丹的EST-SSR引物，是权利要求1中所述Primer1。3.权利要求1所述的牡丹的成套EST-SSR引物的下述A1-A6中的任一种用途：A1、所述成套EST-SSR引物在构建牡丹遗传图谱中的应用；A2、所述成套EST-SSR引物在牡丹种质鉴定中的应用；A3、所述成套EST-SSR引物在牡丹育种中的应用；A4、所述成套EST-SSR引物在牡丹遗传多样性分析中的应用；A5、所述成套EST-SSR引物在牡丹亲缘关系分析中的应用；A6、所述成套EST-SSR引物在牡丹分子标记辅助育种中的应用。4.权利要求2所述的牡丹的EST-SSR引物下述B1-B6中的任一种用途：B1、所述EST-SSR引物在构建牡丹遗传图谱中的应用；B2、所述EST-SSR引物在牡丹种质鉴定中的应用；B3、所述EST-SSR引物在牡丹育种中的应用；B4、所述EST-SSR引物在牡丹遗传多样性分析中的应用；B5、所述EST-SSR引物在牡丹亲缘关系分析中的应用；B6、所述EST-SSR引物在牡丹分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡永红，李健，韩继刚，
申请(专利权)人：上海辰山植物园，
类型：发明
国别省市：上海,31