一种筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法，将不同品种的绿豆种子等量混合后抽提总核酸；构建高通量测序文库；寻找基因组上的变异位点；通过滑动平移筛选高多态性位点；在候选位点两侧设计多重扩增引物；对多重引物的筛选后即获得新的高多态性分子标记位点。理论上本发明专利技术可以一次性筛选出基因组上所有可用的高多态性分子标记位点，并且可以直接用于品种的高通量检测；由于开发过程中已经综合了多个品种的基因组信息，因而不需要传统筛选方法中针对每个样品的反复验证过程；在应用上本方法所筛选出的分子标记位点可以批量检测，不需要对每个分子标记位点一个一个的做分子扩增和检测，因而加快了检测速度，并提高了准确性；本发明专利技术筛选出的分子标记多态性高、分辨率好，且筛选过程简单、快速且流程规范。

A method for screening high polymorphic molecular marker loci of mung bean

The invention discloses a method for screening mung bean high polymorphism molecular markers, different varieties of mung bean seed mix after the extraction of total nucleic acid; construct high-throughput sequencing library; find the mutation sites on the genome; through the slide screening of high polymorphic loci; multiple design primers in candidate loci is acquired on both sides; high molecular markers for the screening of new sites after multiple primer. The theory of the invention can be selected on the genome of all available molecular markers with high polymorphism, and can be used directly for high-throughput species detection; due to the multiple varieties of genomic information has been integrated in the development process, and therefore does not require repeated verification process for each sample of the traditional screening methods; molecular markers in application this method can be selected for batch detection, does not need to be amplified and detected for each molecular marker loci in a molecular, thus accelerating the speed of detection, and improve the accuracy of the present invention; Molecular Marker Polymorphism screened, high resolution, and the screening process is simple, fast and process specifications.

【技术实现步骤摘要】
一种筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法
本专利技术公开了一种筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法，属于生物

技术介绍
分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段，分子标记技术广泛应用于基因定位、遗传图谱分析、法医以及新品种的审定等领域，具有广泛的应用价值和理论研究意义。但是由于受到现有分子标记的开发方法的限制，目前可用的分子标记数量都非常少，甚至某些物种缺乏可用的分子标记位点。在实现本专利技术的过程中，专利技术人发现现有技术至少存在以下问题：传统高多态性分子标记的开发多是依赖于研究者的个人经验，通过大量验证试验来获得，其过程耗费巨大、周期漫长，且不一定能获得真正高多态性的标记位点。而且整个开发过程一次只能找出一个高多态性的分子标记位点，而对于基因组上存在的众多其潜在的高多态性分子标记位点则无能为力。传统的高多态性分子标记在应用中多是一个标记一个标记的检测，无法大规模、高通量的检测多个分子标记位点。部分物种目前有丰富的变异位点信息，但是却不一定会适用于所有的品种。因而批量寻找合适的分子标记位点是目前分子标记的研究和应用的最大障碍。
技术实现思路
针对现有技术中的上述缺陷，本专利技术的主要目的在于提供一种筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法，可以一次性筛选出基因组上所有可用的高多态性分子标记位点，实现批量筛选。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法，包括如下步骤：将不同品种的绿豆种子等量混合后抽提总核酸，构建高通量测序文库；采用高通量测序的方法对所述高通量测序文库进行高覆盖度的测序，获得测序片段；并将测序结果比对到绿豆的参考基因组上；根据比对结果获取所有的突变位点；按照窗口平移获得每个窗口的突变位点的组合数，并将每种组合的测序片段数量换算成所述窗口上所有测序片断的百分比；计算每个窗口的多态性，并评估该窗口是否处于单拷贝区域，得到候选位点；寻找候选位点两侧的保守区域，在所述保守区域设计分子标记的多重扩增引物；对所述多重扩增引物筛选，获得新的高多态性分子标记位点。作为进一步的优选，所述绿豆品种数量大于2个。过少的品种数量将影响分子标记的多态性的评估。作为进一步的优选，所述等量混合为：每个品种之间的基因组摩尔数比例为(0.9-1):(1-1.2)，构建高通量测序文库时不同小种间均匀混合。作为进一步的优选，所述高覆盖度的测序包括：获得可覆盖基因组的核酸测序片段，且所述测序片段数量高于子类的数量。作为进一步的优选，所述将测序结果比对到所述检测物种的参考基因组上，包括：以测序片段为单位展开，标记出每条测序片段上与参考基因组不同的每个碱基位点及其突变类型；把具有相同突变碱基位点和突变类型的reads定义为所述窗口内的一个基因型，获得所述窗口的所有候选基因型。作为进一步的优选，所述窗口平移包括：窗口长度设为L；统计每类基因型的测序片段数量，并除以完整覆盖所述窗口的测序片段的总数量，获得所述基因型的频率。作为进一步的优选，所述单拷贝区域为：基因组上其他位置不存在对单拷贝区域形成干扰的基因组片段。作为进一步的优选，所述在保守区域设计分子标记的多重扩增引物，包括：对于长度为L的一个滑动窗口，窗口在基因组上的起始位置设为S，该窗口终止位置为E，则窗口左侧保守区定义为坐标位置小于S、在测序数据中以及已有的数据中均未发现变异的连续n个碱基位点，窗口左侧保守区定义为坐标位置大于E、在测序数据中以及已有的知识中均未发现变异的连续n个碱基位点(n≥30)。作为进一步的优选，在所述保守区域内设计的引物3末端不含有低复杂序列，如连续多个A，连续的AT重复片段。作为进一步的优选，所述对所述多重扩增引物筛选包括：验证分子标记间的扩增均一性。本专利技术的有益效果是：本专利技术方法包括将不同绿豆品种混合后提取总核酸；构建高通量测序文库；寻找基因组上的变异位点；通过滑动平移筛选高多态性位点；在候选位点两侧设计多重扩增引物；对多重引物的筛选后即获得新的高多态性分子标记位点。理论上本专利技术可以一次性筛选出绿豆基因组上所有可用的高多态性分子标记位点，并且可以直接用于绿豆品种的高通量检测；由于开发过程中已经综合了多个品种的基因组信息，因而不需要传统筛选方法中针对每个样品的反复验证过程；在应用上本方法所筛选出的分子标记位点可以批量检测，不需要对每个分子标记位点一个一个的做分子扩增和检测，因而加快了检测速度，并提高了准确性；筛选出的分子标记多态性高、分辨率好，且筛选过程简单、快速且流程规范。具体实施方式本专利技术通过提供一种筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法，解决了现有技术中高多态性分子标记开发困难的问题。为了解决上述缺陷，本专利技术实施例的主要思路是：本专利技术实施例筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法，包括如下步骤：将不同品种的绿豆种子等量混合后抽提总核酸，构建高通量测序文库；采用高通量测序的方法对所述高通量测序文库进行高覆盖度的测序，获得测序片段；并将测序结果比对到绿豆的参考基因组上；根据比对结果获取所有的突变位点；按照窗口平移获得每个窗口的突变位点的组合数，并将每种组合的测序片段数量换算成所述窗口上所有测序片断的百分比；计算每个窗口的多态性，并评估该窗口是否处于单拷贝区域，得到候选位点；寻找候选位点两侧的保守区域，在所述保守区域设计分子标记的多重扩增引物；对所述多重扩增引物筛选，获得新的高多态性分子标记位点。本专利技术实施例不需要依赖绿豆的现有分子标记的信息，也无需传统的筛选过程中所需要的构建遗传群体信息，只需通过高通量测序可以一次性地检测基因组上所有高多态性的分子标记位点，筛查过程简单、快速且流程规范。在应用上本方法开发出的高多态性分子标记位点的检查方法可以利用扩增子测序技术实现一次扩增和测序就能检查所有分子标记位点，检测方法快速、准确、通量高，普遍适用于各种基于分子标记开展的各项研究和应用。为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。如未加特殊说明，本专利技术中所用试剂均为市场上常见试剂，大多数生物技术公司均有销售，且效果等同。实施例一、绿豆高多态性分子标记位点的筛选本实施例中，选取10个具有表型差异的绿豆品种为材料，本实施例的目的是批量筛选出一批具有高多态性的分子标记位点。一、混合基因组DNA的提取10个绿豆品种每个品种取5粒种子发芽，幼苗长出3天后每株取出0.1g的新鲜叶片，将所有收集起的叶片混合后加入液氮并研磨成粉状，利用植物基因组DNA提取试剂盒(货号：DP305，生产公司：天根生化科技(北京)有限公司)按其操作手册所述的方法提取获得的混合样品的核酸。本方案所用绿豆品种信息见表1。表1.本实施例中所用绿豆品种信息二、高通量测序文库的构建及测序利用紫外分光光度计(NanoDroponeC,赛默飞世尔科技(中国)有限公司)测定核酸的OD260/280值为1.89。用Qubit对提取核酸进行定量，确定提取的DNA浓度达到文库构建的量。采用CovarisSystem超声波打断仪(CovarisM220)，将待测DNA打断成250bp大小，然后按照iontorrent的全基因组文库构建试剂盒构建面PCR扩增的高通量测序文库。采用iontorrentS5高通量测序仪进行测序。构建高本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：包括如下步骤：将不同品种的绿豆种子等量混合后抽提总核酸，构建高通量测序文库；采用高通量测序的方法对所述高通量测序文库进行高覆盖度的测序，获得测序片段；并将测序结果比对到绿豆的参考基因组上；根据比对结果获取所有的突变位点；按照窗口平移获得每个窗口的突变位点的组合数，并将每种组合的测序片段数量换算成所述窗口上所有测序片断的百分比；计算每个窗口的多态性，并评估该窗口是否处于单拷贝区域，得到候选位点；寻找候选位点两侧的保守区域，在所述保守区域设计分子标记的多重扩增引物；对所述多重扩增引物筛选，获得新的高多态性分子标记位点。

【技术特征摘要】
1.一种筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：包括如下步骤：将不同品种的绿豆种子等量混合后抽提总核酸，构建高通量测序文库；采用高通量测序的方法对所述高通量测序文库进行高覆盖度的测序，获得测序片段；并将测序结果比对到绿豆的参考基因组上；根据比对结果获取所有的突变位点；按照窗口平移获得每个窗口的突变位点的组合数，并将每种组合的测序片段数量换算成所述窗口上所有测序片断的百分比；计算每个窗口的多态性，并评估该窗口是否处于单拷贝区域，得到候选位点；寻找候选位点两侧的保守区域，在所述保守区域设计分子标记的多重扩增引物；对所述多重扩增引物筛选，获得新的高多态性分子标记位点。2.根据权利要求1所述的筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：所述绿豆品种数量大于2个。3.根据权利要求1所述的筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：所述等量混合为：每个品种之间的基因组摩尔数比例为(0.9-1):(1-1.2)。4.根据权利要求1所述的筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：所述高覆盖度的测序包括：获得可覆盖基因组的核酸测序片段，且所述测序片段数量高于子类的数量。5.根据权利要求1所述的筛选绿豆高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：所述将测序结果比对到所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伦，方治伟，周俊飞，刘致浩，彭海，高丽芬，李丽丽，陈丽红，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42