一种尿液保存试剂及其应用制造技术

本申请公开了一种尿液保存试剂及其应用。本申请的尿液保存试剂，包括核酸缓冲液、金属离子螯合剂、防腐剂、细胞固定剂和甲醛淬灭剂；核酸缓冲液为Tris‑HCl，工作pH为7‑8；金属离子螯合剂为EDTA；防腐剂为柠檬酸和/或柠檬酸钠；细胞固定剂选自多聚甲醛、重氮烷基脲、咪唑烷基脲和二乙基脲的至少一种；甲醛淬灭剂选自甘氨酸、赖氨酸、乙二胺和精氨酸的至少一种。本申请的尿液保存试剂，能有效保存尿液中游离DNA，避免其降解，为后续的游离DNA检测奠定基础；能阻止尿液中细胞破碎，减小基因组DNA背景，保障游离DNA检测结果准确性。本申请为尿液样本的保存提供了一种新的试剂，为尿液游离DNA临床检测提供了保障。

A urine preservation reagent and its application

The present application discloses a urine preservation reagent and its application. The application of urine storage reagent, including nucleic acid buffer, metal ion chelating agent, preservative, cell fixing agent and formaldehyde quenching agent; nucleic acid buffer for Tris HCl, pH works for 7 8; metal ion chelating agent EDTA; preservatives for citric acid and / or sodium citrate; at least one cell fixation agent selected from paraformaldehyde, diazolidinyl urea, imidazolidinyl urea and ethyl two urea formaldehyde; at least one quenching agent selected from the group consisting of glycine, lysine, arginine and ethylenediamine. The urine preservation reagent of this application can effectively preserve the free DNA in urine and avoid its degradation, so as to lay the foundation for subsequent free DNA detection. It can prevent cell breakage in urine, reduce genomic DNA background, and ensure the accuracy of free DNA detection results. This application provides a new reagent for the preservation of urine samples, which provides a guarantee for the clinical detection of urine free DNA.

【技术实现步骤摘要】
一种尿液保存试剂及其应用
本申请涉及尿液保存领域，特别是涉及一种尿液保存试剂及其应用。
技术介绍
尿液经一系列组织(如膀胱)排出体外，其中存在着相关组织的脱落细胞及游离DNA。尿液是人体排出的一种成分复杂的代谢废弃物，包含各种有机、无机类代谢产物；很多病理性代谢产物还包括蛋白类、糖类物质等；部分病人存在极其严重的血尿现象。同时，尿液成分的复杂性使得许多微生物能够在其中快速繁衍，加上尿液本身的特点，使得其中的核酸极易发生降解。临床上主要使用病灶组织、细胞来对肿瘤患者进行检测、监测等，其弊端在于组织的异质性、对病人的创伤性、取样的难度等。随着测序技术的发展，血液游离DNA(CellfreeDNA,cfDNA)或循环肿瘤DNA(CirculatingtumorDNA,ctDNA)越来越多的被用来进行癌症的早期筛查、靶向诊断、预后评估等。相关文献报道表明，尿液当中也存在游离DNA，并且其核酸突变情况可以有效预测患癌风险及预后评估，如膀胱癌等。但是，尿液中的游离DNA含量很低，并且，在尿液环境下容易降解，与此同时，尿液中的白细胞破碎会释放大量的基因组DNA。这使得，一方面，提取的尿液核酸中游离DNA的含量极低，游离DNA大量降解而达不到检测水平；另一方面，大量的基因组DNA背景，影响检测结果的准确性。因此，亟需研发一种尿液保存试剂，一方面能有效阻止尿液核酸降解，另一方面，又能够固定白细胞阻止其中的基因组DNA释放影响游离DNA检测。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种新的尿液保存试剂及其应用。为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种尿液保存试剂，包括核酸缓冲液、金属离子螯合剂、防腐剂、细胞固定剂和甲醛淬灭剂；核酸缓冲液为Tris-HCl，工作pH范围为7-8；金属离子螯合剂为EDTA；防腐剂为柠檬酸和/或柠檬酸钠；细胞固定剂选自多聚甲醛、重氮烷基脲、咪唑烷基脲和二乙基脲中的至少一种；甲醛淬灭剂选自甘氨酸、赖氨酸、乙二胺和精氨酸中的至少一种。其中，EDTA即乙二胺四乙酸。需要说明的是，本申请的尿液保存试剂，不仅可以对尿液中的游离DNA进行保护，防止其降解；而且，可以有效的阻止尿液中的细胞破碎，减小了因细胞破碎造成的基因组DNA背景。其中，核酸缓冲液为游离DNA提供了基础的存储环境，避免其自行降解；金属离子螯合剂则对尿液中的金属离子进行螯合，从而抑制尿液中各种酶的活性，维持尿液中的白细胞或其它脱落细胞的稳定性，同时，防止游离DNA被核酸酶降解；防腐剂同时具有抗凝血的作用，保障血细胞不致破裂，维持其稳定性；细胞固定剂用于固定尿液中的细胞，使得细胞维持自身形态结构，避免其核酸被释放出来；甲醛淬灭剂主要是与游离的甲醛反应，淬灭游离甲醛，避免其对游离DNA造成损伤，甲醛淬灭剂使得尿液中的游离DNA能够维持自身的结构稳定、保持生物学性能。以上各组分相互配合，起到保护游离DNA和避免细胞破碎释放基因组DNA的目的。本申请的尿液保存试剂能够将尿液在4℃的环境下保存至少10天，而其中的游离DNA不发生明显降解；在-20℃或-80℃下可以长期保存。不过，需要注意的是，如果需要-20℃或-80℃长期保存，应尽量避免反复冻融。还需要说明的是，核酸缓冲液、金属离子螯合剂、防腐剂、细胞固定剂和甲醛淬灭剂各组分的用量，按照各组分的常规有效化学剂量使用即可，但是，在本申请的优选方案中，对各组分用量进行了特别限定，以达到更好的尿液中游离DNA的保存效果，详见以下方案。其中，常规有效化学剂量是指化学试剂能够正常发挥其理化功能的剂量，排除一些极端的浓度或用量情况。优选的，Tris-HCl的浓度为1.25-2mmol/L。优选的，EDTA的浓度为5-15mmol/L。优选的，柠檬酸的浓度为1-1.50mmol/L，柠檬酸钠的浓度为3.25-4.0mmol/L。更优选的，防腐剂同时采用柠檬酸和柠檬酸钠。优选的，细胞固定剂的浓度为重量份0.05％-0.1％。更优选的，细胞固定剂同时采用多聚甲醛、重氮烷基脲和咪唑烷基脲。优选的，甲醛淬灭剂的浓度为20-40mmol/L。更优选的，甲醛淬灭剂同时采用甘氨酸、赖氨酸和乙二胺。本申请的另一面公开了本申请的尿液保存试剂在尿液或体液的保存中的应用。本申请的尿液保存试剂，能够针对尿液环境，对其中的游离DNA进行有效保护，并且能够避免尿液中脱落细胞和白细胞破碎，减小基因组DNA对游离DNA的影响，从而为尿液中游离DNA的检测奠定了基础。可以理解，本申请的尿液保存试剂不仅可以用于尿液的保存，其它类似的体液，也可以采用本申请的尿液保存试剂。由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：本申请的尿液保存试剂，一方面，能够有效的保存尿液中的游离DNA，避免其自身降解，也避免其被核酸酶降解，为后续的游离DNA检测奠定了基础；另一方面，能够阻止尿液中的细胞破碎，减小细胞破碎造成的基因组DNA背景，保障了游离DNA检测结果的准确性。本申请的尿液保存试剂，为尿液样本的保存提供了一种新的试剂，为尿液游离DNA的临床检测提供了保障。附图说明图1为本申请实施例中样本1分别添加本申请的尿液保存试剂、对比尿液保存试剂，以及不添加任何试剂直接保存，样本1的尿液经过离心处理，分别保存1天、3天、5天、7天和10天后提取的核酸浓度曲线图，图中，◆曲线为样本1试验一的曲线，■曲线为样本1试验二的曲线，▲曲线为样本1试验三的曲线；图2为本申请实施例中样本2分别添加本申请的尿液保存试剂、对比尿液保存试剂，以及不添加任何试剂直接保存，样本2的尿液经过离心处理，分别保存1天、3天、5天、7天和10天后提取的核酸浓度曲线图，图中，◆曲线为样本2试验一的曲线，■曲线为样本2试验二的曲线，▲曲线为样本2试验三的曲线；图3为本申请实施例中样本2分别添加本申请的尿液保存试剂、对比尿液保存试剂，以及不添加任何试剂直接保存，样本2的尿液不进行离心处理，分别保存1天、3天、5天、7天和10天后提取的核酸浓度曲线图，图中，◆曲线为样本2试验四的曲线，■曲线为样本2试验五的曲线，▲曲线为样本2试验六的曲线；图1至图3中，横坐标为保存天数；纵坐标为核酸浓度，单位为ng/μL。具体实施方式虽然尿液中也存在游离DNA，可以作为膀胱癌等泌尿道相关癌症风险预测和预后评估，但是，尿液游离DNA量少，并且，相对于血液游离DNA而言，尿液游离DNA的环境更加复杂，检测难度更高，这极大的影响了尿液游离DNA的临床检测。本申请经过研究发现，影响尿液游离DNA检测的关键因素有两个，一是尿液游离DNA容易降解，进一步减少了尿液游离DNA的量；二是基因组DNA背景严重，影响尿液游离DNA检测的准确性。本申请研究发现，造成尿液游离DNA降解的因素包括：(1)自身降解，(2)核酸酶降解；而基因组DNA背景主要来源于细胞破碎释放的DNA。基于以上认识，本申请创造性的研发了一种新的尿液保存试剂，用于保存尿液中的游离DNA，并减少基因组DNA背景。本申请的尿液保存试剂有效的保障了后续游离DNA的检测，一方面，是因为尿液保存试剂可以有效的保存尿液中的游离DNA，避免其降解，保障了其含量，避免因降解而达不到检测水平；另一方面，通过阻止细胞破碎，减少细胞释放基因组DNA，从而减小了基因组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种尿液保存试剂，其特征在于：包括核酸缓冲液、金属离子螯合剂、防腐剂、细胞固定剂和甲醛淬灭剂；所述核酸缓冲液为Tris‑HCl，工作pH范围为7‑8；所述金属离子螯合剂为EDTA；所述防腐剂为柠檬酸和/或柠檬酸钠；所述细胞固定剂选自多聚甲醛、重氮烷基脲、咪唑烷基脲和二乙基脲中的至少一种；所述甲醛淬灭剂选自甘氨酸、赖氨酸、乙二胺和精氨酸中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种尿液保存试剂，其特征在于：包括核酸缓冲液、金属离子螯合剂、防腐剂、细胞固定剂和甲醛淬灭剂；所述核酸缓冲液为Tris-HCl，工作pH范围为7-8；所述金属离子螯合剂为EDTA；所述防腐剂为柠檬酸和/或柠檬酸钠；所述细胞固定剂选自多聚甲醛、重氮烷基脲、咪唑烷基脲和二乙基脲中的至少一种；所述甲醛淬灭剂选自甘氨酸、赖氨酸、乙二胺和精氨酸中的至少一种。2.根据权利要求1所述的尿液保存试剂，其特征在于：所述Tris-HCl的浓度为1.25-2mmol/L。3.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋卓，王永利，高堂杰，何庆，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43