一种染色质破碎方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种染色质破碎方法及其应用，所述方法包括：甲醛交联、缓冲液处理、微球菌核酸酶消化及超声破碎。本发明专利技术通过将超声破碎和微球菌酶切两种手段相结合，并研制出适合该方法的缓冲溶液，能够避免染色质片段弥散和酶切序列特异性问题，减少蛋白质变性的几率，节省时间和试剂。该方法能够快速稳定地得到均一的染色质片段并用于ChIP‑Seq的文库构建或染色质免疫共沉淀，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

A method of chromatin crushing and its application

The invention provides a chromatin crushing method and its application. The methods include formaldehyde crosslinking, buffer solution treatment, Micrococcus nuclease digestion and ultrasonic crushing. The invention combines the two means of ultrasonic crushing and Micrococcus enzyme digestion, and develops a buffer solution suitable for this method, which can avoid the problem of chromatin fragment dispersion and sequence specificity, reduce the probability of protein denaturation, save time and reagent. The method can quickly get chromatin fragments in uniform and for the construction of Seq Library of ChIP or chromatin immunoprecipitation, and has wide application prospect and huge market value.

【技术实现步骤摘要】
一种染色质破碎方法及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种染色质破碎方法及其应用
技术介绍
染色质免疫共沉淀技术(chromatin-immunoprecipitation，ChIP)能够真实完整的反映结合在DNA序列上的靶蛋白的调控信息，其基本原理：通过特定时间点上用甲醛交联等方式固定细胞内所有DNA结合蛋白的活动，通过后续的裂解细胞、分离染色体，通过超声等将染色质随机切割，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来，再通过解交联释放结合蛋白的DNA片段，纯化后进行下游分析。ChIP-Seq是将高通量测序技术与ChIP实验相结合分析全基因组范围内DNA结合蛋白位点、DNA甲基化、组蛋白修饰等的深度测序技术。通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究，有助于了解基因之间的相互调控以及染色体的功能结构，其优势主要有分辨率高(碱基水平)、灵敏度高(需要样品量少)，灵活性强等。目前随着测序成本的不断降低及通量迅速增高等优势，ChIP-Seq基本上取代了ChIP-chip成为研究转录因子、RNA聚合酶、核小体等DNA结合蛋白体内结合靶点的主打技术。在ChIP-Seq技术中，文库的构建是非常重要的一步，文库构建的质量直接影响测序结果的准确性。而在文库构建过程中能否快速稳定的将染色质破碎成均一大小的片段极为重要。CN106834208A公开了一种染色质免疫共沉淀中裸鼹鼠组织的超声破碎方法，所述超声破碎方法为首先向裸鼹鼠组织中加入体积比为1:1:1的胶原酶Ⅱ溶液、透明质酸酶溶液、DPBS缓冲液的混合溶液，37℃震荡消化组织，离心去除上清，然后进行常规超声破碎步骤。CN104651506A公开了一种应用于组织样本中组蛋白修饰染色体免疫共沉淀方法，首先进行组织样本前处理；然后在冰浴中研磨后，用无菌纱布过滤，收集滤液中的细胞，悬浮在酶切消化缓冲液中水浴；将加入酶切消化缓冲液的细胞，加入微球菌核酸酶，酶切后，加入与微球菌核酸酶等量的酶切终止液；在冰浴下进行高频超声并离心处理，得到破碎的染色质溶液；取ProteinA/G，加入含牛血清白蛋白的PBS缓冲液，再加抗体孵育，加入破碎的染色质溶液，过夜孵育；在磁力架上用高盐溶液多次洗涤，洗涤后用TE溶液洗脱磁力珠上的DNA，用纯化液纯化提取DNA，用超纯水溶解DNA。目前常用于染色质破碎的一种方法是利用机械力破碎即超声的方法获得一定大小的染色质片段。根据不同的细胞样品以及建库所需要的片段大小的不同，所利用的超声参数不同。其缺点主要有以下几点：①当需要获得比较小的片段时(一般片段小于200bp时)，超声时间和超声功率都需增加，这会大大增加蛋白质变性的几率，影响后续的抗体与蛋白质的特异性结合。②超声得到的DNA片段大小虽然相对集中于某一位置，但是其大小弥散范围过宽，这会导致其一：DNA量为达到建库要求，超声样品量需大大增加；其二：由于超声得到的DNA弥散较宽，而建库时选用的DNA大小范围相对较窄，这除了会造成上述的样品浪费，还可能会导致建库选用DNA的偏好性，影响最终测序结果。另一种常见的染色质破碎的方法是利用酶切得方法获得一定大小的染色质片段，常用的酶为微球菌核酸酶(MicrococcalNuclease，MNase)，微球菌核酸酶是只降解核小体连接区DNA的核酸酶，由于核小体处的DNA被组蛋白保护而不被降解，因此能够破碎染色质。如果单纯使用微球菌核酸酶作为破碎手段其主要缺点有以下几点：①微球菌核酸酶在切断DNA时具有一定程度的序列特异性，因此破碎染色质时可能会出现序列偏好性问题。②酶量难以控制，容易产生酶切不均匀的现象，即会产生不同大小的染色质片段，切断单个核小体时大小为150bp左右，两个核小体时300bp左右，因此当单纯使用酶作为染色质破碎手段时，容易出现这种不同大小片段混杂的现象。目前所用的方法虽然能勉强满足文库构建的基本要求，但是都存在着：需样品量大、成本大、耗时长、序列偏好性破碎等问题，因此需要一种能够快速方便适合实验室研究人员使用的染色质破碎方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种染色质破碎方法及其应用，所述方法简洁高效，将超声破碎与微球菌核酸酶消化相结合，摸索出相应的缓冲液，避免了蛋白质变性及酶切序列偏向性等问题，得到均一稳定的产物，满足ChIP-Seq建库要求。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种染色质破碎的方法，包括如下步骤：(1)用甲醛交联的方法固定细胞；(2)将细胞离心后用缓冲液处理；(3)将处理后溶液用微球菌核酸酶消化并超声破碎。专利技术人通过大量的实验探究和长时间的摸索，发现通过超声加酶切混合破碎染色质，克服了现有技术的缺点，能够避免染色质片段弥散和酶切序列特异性问题，减少蛋白质变性的几率，节省时间和试剂，减少超声的时间，降低超声的功率，更好的破碎染色质，满足ChIP-Seq建库要求。优选地，步骤(2)所述缓冲液包括缓冲液A、缓冲液CF1、缓冲液CF2、缓冲液N1和缓冲液N2中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是缓冲液A和缓冲液CF1的组合，缓冲液CF1和缓冲液CF2的组合，缓冲液N1和缓冲液N2的组合或缓冲液A、缓冲液CF1、缓冲液CF2、缓冲液N1和缓冲液N2的组合，优选为缓冲液A、缓冲液CF1、缓冲液CF2、缓冲液N1和缓冲液N2的组合。优选地，所述缓冲液A包括：Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、MgCl2、DTT(二硫苏糖醇)和PMSF(苯甲基磺酰氟)中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是Hepes和MgCl2的组合，DTT和MgCl2的组合，DTT和PMSF的组合或Hepes、MgCl2、DTT和PMSF，优选为Hepes、MgCl2、DTT和PMSF的组合。优选地，所述Hepes的pH为7.8-8，例如可以是7.8、7.9或8.0，优选为7.9。优选地，所述Hepes的终浓度为8-12mM，例如可以是8mM、9mM、10mM、11mM或12mM，优选为10mM。优选地，所述MgCl2的终浓度为0.5-2mM，例如可以是0.5mM、0.8mM、1mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM或2mM，优选为1.5mM。优选地，所述DTT的终浓度为0.5-2mM，例如可以是0.5mM、0.8mM、1mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM或2mM，优选为1mM。优选地，所述PMSF的终浓度为0.2-1mM，例如可以是0.2mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.8mM或1mM，优选为0.5mM。本专利技术中，专利技术人通过长期实验摸索和验证，选择特异组分和浓度的缓冲液，能够适应并匹配超声加酶切混合破碎染色质的方法，协助发挥该方法的最佳作用效果，避免染色质片段弥散和酶切序列特异性问题，减少蛋白质变性的几率，节省时间和试剂。优选地，所述缓冲液CF1包括KCl、NP40(NonidetP40，乙基苯基聚乙二醇)和缓冲液A中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是缓冲液A和KCl的组合，缓冲液A和NP40的组合或缓冲液A、NP40和KCl的组合，优选为缓冲液A、NP40和KCl的组合。优选地，所述KCl的终浓度为5-15mM，例如可以是5m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种染色质破碎方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)用甲醛交联的方法固定细胞；(2)将细胞离心后用缓冲液处理；(3)将处理后溶液用微球菌核酸酶消化并超声破碎。

【技术特征摘要】
1.一种染色质破碎方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)用甲醛交联的方法固定细胞；(2)将细胞离心后用缓冲液处理；(3)将处理后溶液用微球菌核酸酶消化并超声破碎。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述缓冲液包括缓冲液A、缓冲液CF1、缓冲液CF2、缓冲液N1和缓冲液N2中的任意一种或至少两种的组合，优选为缓冲液A、缓冲液CF1、缓冲液CF2、缓冲液N1和缓冲液N2的组合。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液A包括：Hepes、MgCl2、DTT和PMSF中的任意一种或至少两种的组合，优选为Hepes、MgCl2、DTT和PMSF的组合；优选地，所述Hepes的pH为7.8-8，优选为7.9；优选地，所述Hepes的终浓度为8-12mM，优选为10mM；优选地，所述MgCl2的终浓度为0.5-2mM，优选为1.5mM；优选地，所述DTT的终浓度为0.5-2mM，优选为1mM；优选地，所述PMSF的终浓度为0.2-1mM，优选为0.5mM。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述缓冲液CF1包括KCl、NP40和缓冲液A中的任意一种或至少两种的组合，优选为KCl、NP40和缓冲液A的组合；优选地，所述KCl的终浓度为5-15mM，优选为10mM；优选地，所述NP40的质量百分数为0.1-5％，优选为1％。5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲液CF2包括KCl、NaCl、甘油、NP40和缓冲液A中的任意一种或至少两种的组合，优选为KCl、NaCl、甘油、NP40和缓冲液A的组合；优选地，所述KCl的终浓度为5-15mM，优选为10mM；优选地，所述NP40的质量百分数为0.1-1％，优选为0.5％；优选地，所述NaCl的终浓度为50-100mM，优选为75mM；优选地，所述甘油的质量百分数为5-15％，优选为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨海洋，李翔，钱政江，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44