簇中的表面引物的增强利用制造技术

本申请提供了用于在表面扩增过程中增强表面引物利用的方法和组合物。这些方法对于提高密度的表面扩增是有用的。本申请提供的方法和组合物能够在与目前使用标准簇扩增可以达到的相同密度下产生更加明亮的簇。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】簇中的表面引物的增强利用
技术介绍
将人类遗传变异进行编目并将这种变异与疾病易感性相关联的工作是艰巨且昂贵的。使该成本显著降低对于促进对健康和疾病的理解是必不可少的。降低测序成本需要在该领域出现很多技术进步。能够降低基因组分析成本的技术进步包括：(1)产生文库；(2)高度并行的克隆扩增和分析；(3)发展耐用的循环测序生化方法；(4)发展超快成像技术；以及(5)发展用于由短读取进行序列组装的算法。以高度并行方式产生克隆扩增对于节约成本的测序是重要的。测序通常是在传统上由从挑取单个细菌集落生长的质粒制备的DNA分子的克隆群体上进行的。在人类基因组计划中，单独挑取每个克隆、使其生长以及从克隆中提取和扩增DNA。近年来，已经涌现出一些创新使得能够对DNA克隆进行高度并行的分析，特别是基于阵列的方法。在最简单的方法中，可以在其本质上是克隆的单分子水平对文库进行分析。单分子测序的主要优点是循环测序可以异步进行，因为每个分子都是单独读取的。相比之下，克隆扩增分析需要每个测序循环均接近定量完成，否则随着每个随后循环的进行背景噪音持续增加，这严重限制了读取长度。因此，克隆分析对测序生化方法的耐用性造成了更大负担并且可能潜在限制了读取长度。因而，存在开发方法以改进基因组分析以及提供用于序列分析的更加节约成本的方法的需求。本专利技术满足了这种需求并且还提供了相关优点。专利技术概述本申请提供了在提高的密度下能够表面扩增的方法和组合物。本申请描述了用于在表面扩增过程中增强表面引物利用的方法。该方法对于在提高的密度下的表面扩增是有用的。本申请提供的方法和组合物能够在与目前使用标准簇扩增可以达到的相同密度下产生更加明亮的簇。更加明亮的簇可以具有多种优点例如，更好的读取质量、支持更长的读取长度、更快的测序扫描时间以及增加的系统耐用性。本申请提供了用于制备用于核酸测序反应的固定化模板的方法和组合物，包括：(a)提供具有固定在其上的多个正向和反向扩增引物的固体支持物，其中多个扩增引物的一个子集包含裂解位点；(b)使用在支持物上引物的子集扩增模板以产生多个双链核酸分子，其中每个双链核酸分子的两条链在其5’末端附接至固体支持物；(c)在裂解位点裂解引物的子集；以及(d)将裂解的链置于部分变性条件下以促进扩增产物非固定化链的一部分与互补的固定化扩增引物杂交，随后将固定化的扩增引物延伸，以产生扩增产物非固定化链的副本。在一些实施方式中，部分变性条件包括加入重组酶/聚合酶扩增反应的一个或多个组分以促进链侵入。在一些实施方式中，部分变性条件包括将模板置于适于模板步移(templatewalking)的条件下。在一些实施方式中，步骤(d)包括应用在溶液中的引物以促进引物与固定化扩增产物的非固定化末端杂交。在下述的附图和说明书中描述了一个或更多个实施方式的细节。其他特征、目标和优点将是从说明书和附图以及从权利要求中显而易见的。附图说明图1是显示根据一个实施方式的扩增方法的示意图。图2是显示根据一个实施方式的扩增方法的示意图。图3显示了根据不同方法扩增的SyBrGreen染色簇的比较结果。图4显示了根据不同方法扩增的簇的比较结果。上面的图显示了在第一轮核苷酸掺入后的成像扫描。下面的图显示了在各道中簇的Cy3和Cy5染色结果。图5是显示用于产生配对端匝(endturn)的替代方法的示意图。图6是显示在图5中所示方法的附加步骤的示意图。专利技术详述本申请提供了用于在表面扩增过程中增强表面引物利用的方法和组合物。该方法对于在提高的密度下的表面扩增是有用的。本申请提供的方法和组合物能够在与目前使用标准簇扩增可以达到的相同密度下产生更加明亮的簇。目前可用的测序技术利用表面扩增在固体支持物上形成扩增核酸的簇。包括桥连扩增和等温扩增在内的最常用的方法可以使用动力学排阻扩增(KEA)(也称为排阻扩增[ExAmp])进行。这两种扩增方法均利用固定化在固体支持物上的2种不同表面引物(正向和反向)。然而，桥连和ExAmp簇扩增方法均不能充分利用2种表面引物。目前的估计是<10％的表面引物扩增后转化为模板链。存在对能够更加耐用地利用现有表面引物的改进表面扩增方法的需求。能够利用更高比例表面引物的方法将在测序期间所得到的簇的亮度和信号受限测序平台中提高测序质量方面提供更大益处。本申请提供了用于增强表面引物占据的方法，使得能够形成具有更高核酸扩增产物密度的簇并且在通过合成测序过程中产生显著改善的信号。在本申请中呈现的某些实施方式中，扩增方法包括进行标准桥连或ExAmp扩增程序。在标准扩增完成后，将两种表面引物中的一种裂解并从固体支持物上除去。仅在一个末端束缚扩增分子，但是其以dsDNA形式存在。然后在部分变性条件下进行随后的扩增循环以促进扩增产物非固定化链的一部分与互补的固定化扩增引物杂交，随后将固定化的扩增引物延伸，以产生扩增产物非固定化链的副本。在图1中示出了对根据一个实施方式的方法的一般性描述。如图1中所示，使用在表面上存在的正向引物和反向引物进行初始表面扩增过程。在图1中将正向和反应引物表示为“P7”和“P5”，但是应当意识到可以使用任意表面结合的正向和反向扩增引物进行本申请所述的方法。可以使用本领域公知的任何适宜的扩增程序进行初始表面扩增过程，例如通过桥连扩增或重组酶/聚合酶扩增(RPA)，在图1中也称为ExAmp。在最初一轮扩增后，大部分表面结合的正向和反向引物仍未延伸。尽管不希望受到理论的束缚，但是在桥连和/或RPA扩增过程中表面引物利用较低可能是由于空间位阻或其他物理限制导致的，因为模板分子需要将2个表面引物“桥连”。接下来，如图1中所示，将表面结合引物的一个子集从表面上裂解下来。所裂解的表面结合引物的子集可以是例如正向引物或者替代地是反向引物。应当意识到的是，在一些实施方式中，不是所有的正向或反向引物均从表面上裂解下来。例如，在反向引物(P5)裂解后，P5引物的一部分可能仍保持与表面的结合。在一些实施方式中，最初结合的正向引物的少于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或者少于5％仍与表面结合。在一些实施方式中，最初结合的反向引物的少于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或者少于5％仍与表面结合。在图1中所示的实施方式中，裂解步骤裂解未延伸的和延伸的P5引物。因而，裂解后，裂解引物中的一些仍通过线性化的桥结构栓系到固体支持物上。裂解的、未延伸的引物将在溶液中并且如有需要可以通过洗涤步骤将其从固体支持物上除去。尽管在整个本说明书中使用术语P5和P7表示反向和正向引物，但是应当意识到的是，本申请所述的方法不限于仅裂解反向引物。在附图所述实施方式的替代实施方式中，可以将正向引物裂解，将反向引物固定化在固体支持物上。可以在本申请所述的方法中使用多种可裂解的寡核苷酸、可裂解的接头和裂解方法中的任意一种。从固体支持物上裂解寡核苷酸的方法是本领域公知的，如美国专利号8,715,966公开的内容所示例的，其全部内容通过引用并入本申请。例如，可以通过化学、光化学、酶促或任意其他适宜的方法裂解寡核苷酸引物，所述方法将寡核苷酸引物的全部或一部分从固体支持物上裂解。裂解位点可以是例如位于在寡核苷酸合成过程中预本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备用于核酸测序反应的固定化模板的方法，所述方法包括：(a)提供具有固定在其上的多个正向和反向扩增引物的固体支持物，其中所述多个扩增引物的子集包含裂解位点；(b)使用在所述支持物上所述引物的子集扩增模板以产生多个双链核酸分子，其中每个双链核酸分子的两条链在其5’末端附接至所述固体支持物；(c)在所述裂解位点裂解所述引物的子集；以及(d)将裂解的链置于部分变性条件下以促进所述扩增产物非固定化链的一部分与互补的固定化扩增引物杂交，随后将所述固定化的扩增引物延伸，以产生所述扩增产物非固定化链的副本。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.29 US 62/168,6021.一种制备用于核酸测序反应的固定化模板的方法，所述方法包括：(a)提供具有固定在其上的多个正向和反向扩增引物的固体支持物，其中所述多个扩增引物的子集包含裂解位点；(b)使用在所述支持物上所述引物的子集扩增模板以产生多个双链核酸分子，其中每个双链核酸分子的两条链在其5’末端附接至所述固体支持物；(c)在所述裂解位点裂解所述引物的子集；以及(d)将裂解的链置于部分变性条件下以促进所述扩增产物非固定化链的一部分与互补的固定化扩增引物杂交，随后将所述固定化的扩增引物延伸，以产生所述扩增产物非固定化链的副本。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述部分变性条件包括加入重组酶/聚合酶扩增反应的一个或多个组分以促进链侵入。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述部分变性条件包括将所述模板置于适于模板步移(templatewalking)的条件下。4.根据权利要求1所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：JM鲍特尔，GM斯金纳，
申请(专利权)人：伊卢米纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB