通过与固定化寡核苷酸形成三螺旋纯化DNA的方法技术

本发明专利技术涉及一种双链ＤＮＡ的纯化方法。根据这种方法，将含有所述ＤＮＡ和其他成分的混合物溶液通过与一寡核苷酸共价偶联的载体，该寡核苷酸能够通过杂交与所述ＤＮＡ中存在的特定序列形成三螺旋。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及纯化DNA的新方法。本专利技术方法能快速分离得到适于药理应用的双链DNA。具体讲，本专利技术的纯化方法涉及DNA序列与寡核苷酸之间的特异杂交。基因治疗和细胞治疗技术如今正在迅猛发展。但这些技术涉及能否产生大量药学纯DNA的问题。实际上，在这些新疗法中药物经常由DNA本身构成，所以适量地制备DNA、以适于人体治疗应用的方式分离和纯化DNA的能力是很重要的。本专利技术描述一种纯化DNA的简便而特别有效的新方法，这种方法尤其能获得高纯度和高产率。本专利技术方法关键在于待纯化的被插入DNA序列与由天然或修饰碱基组成的寡核苷酸之间的特异性相互作用。最近已表明某些寡核苷酸能够在DNA双螺旋的大沟槽中特异性地相互作用局部形成三螺旋，导致对靶基因转录的抑制(Helene和Toulme，生化生物物理杂志，1049(1990)99)。这些寡核苷酸在寡聚嘌-呤寡聚嘧啶序列水平(即在这样的区域寡聚嘌呤序列在一条链上，寡聚嘧啶序列在其互补链上)识别DNA双螺旋，并在此局部形成三螺旋。第三条链(寡核苷酸)的碱基与Watson-Crick碱基对的嘌呤形成氢键(Hoogsteen键或反Hoogsteen键)。现有技术中已描述了此类相互作用在分离质粒中的应用。例如，Ito等(PNAS 89(1992)495)描述了一些生物素化寡核苷酸的应用，这些寡核苷酸能够识别某质粒决定的序列并与其形成三螺旋。这样形成的复合物随后与包有抗生蛋白链菌素的磁珠接触。生物素与抗生蛋白链菌素间的相互作用使得能够通过磁力分离磁珠然后洗脱而分离质粒。但该方法存在一些缺点。特别是需要两种连续的特异相互作用，第一种是寡核苷酸与质粒间，第二种是生物素化复合物和抗生蛋白链菌素珠之间。另外，最终溶液可能被生物素化寡核苷酸污染，而后者不能用于药物组合物中。本专利技术描述一种利用这种相互作用的改进的纯化DNA新方法。更具体地讲，本专利技术方法使用与载体共价偶联的寡核苷酸。该方法特别快，并产生特别高的产率和纯度。另外，本方法能从尤其含有其他核酸、蛋白、内毒素(如脂多糖)、核酸酶等的复杂混合物中纯化DNA。所用载体易于回收，所得DNA具有改善的药物安全性。最后，该方法仅含有一个步骤，不同于现有技术。本专利技术的第一个目的在于一种双链DNA的纯化方法，根据该方法，将含有所述DNA和其他成份的混合物溶液在一共价偶联有一寡核苷酸的载体上通过，所述寡核苷酸能够通过杂交与所述DNA中某特定序列形成三螺旋。该特异序列可以是双链DNA上天然存在的序列或人工引入其中的合成序列。用于本专利技术的寡核苷酸是与双链DNA直接杂交的寡核苷酸。这些寡核苷酸可含有下列碱基-胸腺嘧啶(T)，它能与双链DNA的A-T二联体形成三联体(Rajagogal等，生物化学28(1989)7889)；-腺嘌蛉(A)，它能与双链DNA的A-T二联体形成三联体；-鸟嘌呤(G)，它能与双链DNA的G-C二联体形成三联体；-质子化胞嘧啶(C+)，它能与双链DNA的G-C二联体形成三联体(Rajagogal等，同上)；-尿嘧啶(U)，它能与A-U或A-T碱基对形成三联体。优选地，所用的寡核苷酸包含一种富集胞嘧啶的高嘧啶序列，DNA中的特定序列则为一种高嘌呤-高嘧啶序列。胞嘧啶的存在使得形成酸性pH下稳定的三螺旋，此时胞嘧啶被质子化，而在碱性pH下胞嘧啶被中和，三螺旋不稳定。为了通过杂交形成三螺旋，寡核苷酸与DNA上的特异序列互补是很重要的。为了获得最佳产率和最佳选择性，在本专利技术方法中应使用完全互补的寡核苷酸和特定序列。特别可以是多聚CTT寡核苷酸和多聚GAA特异序列。例如，寡核苷酸序列可以是5＇-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(GAGG(CTT)7；(SEQ ID NO.1)，其中碱基GAGG不形成三螺旋，但使寡核苷酸与偶联臂间有一间隔；还可以指出序列(CTT)7(SEQ IDNo.26)。这些寡核苷酸能够与含有互补基元(GAA)的特定序列形成三螺旋。尤其涉及到如实施例中所述包含7、14或17个GAA基元的区域。另一个具有特异性的序列是如下序列5′-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3′(SEQ ID n°5)该序列与下列寡核苷酸形成三螺旋5′-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3′(SEQ ID n°6)或5′-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3′(SEQ ID n°7)此时，寡核苷酸以与多嘌呤链反向平行的方向定位。这些三螺旋在Mg2+存在下不稳定(Vasguez等，生物化学，1995，34，7243-7251；Beal和Dervan，科学，1991，251，1360-1363)。如上文所指出的那样，特定序列可以是双链DNA上天然存在的序列，或者人工引入其中的合成序列。使用能与双链DNA上天然存在的序列形成三螺旋的寡核苷酸特别有意义，例如存在于质粒复制起始区或基因标志区中的天然序列。关于这一点，申请人进行了质粒序列的分析，并表明这些DNA的某些区域(尤其是复制起始区)可能具有高嘌呤-高嘧啶区。合成能与这些高嘌呤-高嘧啶区形成三螺旋的寡核苷酸，则可以用未经修饰的质粒(尤其是pUC，pBR322、pSV等类型的商业质粒)有利地实施本专利技术的方法。对天然存在于双链DNA中的高嘌呤-高嘧啶序列，可以列举大肠杆菌复制起始区colE1中的含序列5＇-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3′(SEQID No.2)的全部或一部分的序列。此时，形成三螺旋的寡核苷酸具有这样的序列5′-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3′(SEQ ID No.3)，并如Beal和Dervan(美国化学协会杂志，1992，114，4976-4982)及Jayasena和Johnston(核酸研究，1992，20，5279-5288)所述在双螺旋的两条链上择一固定。还可以举出质粒pBR322的β-内酰胺酶基因的5＇-GAAAAAGGAAGAG-3′(SEQ ID No.4)序列(Duval-valentin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，504-508)。应用能与复制起动区或基因标志区中存在的序列形成三螺旋的寡核苷酸特别有利，因为用相同的寡核苷酸可以纯化所有含所述复制起始区或所述基因标志区的DNA。这样就没有必要为使其含有人工特异序列而修饰质粒或双链DNA。虽然优选那些完全互补的序列，但应认识到只要不引起太大的亲和力损失，在寡核苷酸序列和DNA中序列间容许有一定的错配。可举出大肠杆菌β-内酰胺酶基因中的序列5′-AAAAAAGGGAATAAGGG-3′(SEQ IDNo.8)，其中中断多嘌呤序列的胸嘧啶可能被第三条链的鸟嘌呤所认别，从而形成ATG三联体，它在被夹在两个TAT三联体之间时是稳定的(Kiessling等，生物化学，1992，31，2829-2834)。根据一种特别的实施方案，本专利技术的寡核苷酸包含(CCT)n序列、(CT)n序列或(CTT)n序列，其中n为包括端点的1-15间的整数。使用(CT)n或(CTT)n型序列特别有利。实际上申请人已证明纯化产率受寡核苷酸中C的含量的影响。特别如实施例7中所示，当寡核苷酸含有较少胞嘧啶时则纯化收率提高。应认识到，本专利技术的寡核本文档来自技高网...

【技术保护点】
双链ＤＮＡ的纯化方法，其特征在于包括至少以下步骤：将含所述ＤＮＡ和其他成份的混合物溶液通过共价偶联有寡核苷酸的载体，其中寡核苷酸能够通过杂交与所述ＤＮＡ中存在的特定序列形成三螺旋。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J克罗泽特，D施尔曼，P威尔斯，
申请(专利权)人：森泰莱昂公司，
类型：发明
国别省市：FR[]