用于肾病诊断和治疗中的尿样分析的方法和组合物技术

本发明专利技术包括新的组合物、系统和方法来分析生物学样品如尿液样品，以便诊断和治疗肾疾病，这些肾疾病包括但不限于肾小球性肾炎、肾病综合征、糖尿病、狼疮、高血压、急性肾小管坏死、尿路塞疾病、肾癌以及其他疾病或综合征。在较佳的实施方案中，本发明专利技术包括鉴别尿道中仅在临床或科学上特别感兴趣的细胞（如足细胞或近端小管细胞）中表达的特定基因。因此，本发明专利技术能以非侵入性的方式迅速正确地分析多个疾病和紊乱中肾和尿道的状况和功能。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及诊断和治疗肾病中生物学样品的分析。具体地说，本专利技术涉及通过分析尿样来诊断和监测肾病以及与各种症状(包括但不限于肾小球性肾炎、肾病综合征、糖尿病、狼疮、高血压、急性肾小管坏死(ATN)、肾阻塞性疾病、肾癌)有关的疾病以及其他疾病或综合征的治疗进展情况。
技术介绍
医师在治疗患者时通常需要分析肾状态和功能。对于诸如肾小球疾病，目前是通过检测尿液中的蛋白质(白蛋白)，即测定从肾中排入尿液中的蛋白质的量来实现的。然而，这种方法并不灵敏，其根本原因是许多肾在异常测试结果出现之前就已丧失功能。这种方法也不正确，因为尿液中出现蛋白有许多不明确的原因，所以测试升高的变性蛋白尿(albuminuria)在许多受试者中呈假阳性。而且，对于某些肾疾病，如近端小管疾病，通常不能进行灵敏的基于尿液的测试。另一种分析方法是肾活检。该方法很昂贵，是侵入性的，而且由于存在出血和感染的危险，与有限的发病率相关。目前唯一可用来直接监测足细胞(即足状突细胞，podocyte)疾病的基于尿液的测试(只在实验水平采用)是用抗体测试肾分泌出的足细胞。然而，该方法并不如我们所提供的方法那样灵敏，因为它仅仅是在尿液中存在白蛋白时才会呈现出异常。因此，需要有一种特定的通常可行的测试，该测试能在肾疾病的早期、较佳是靠近开始时就显示与肾功能不良相关的阳性结果。本专利技术通过采用新的肾状态或功能的指标解决了这一情况，通过将一种该细胞特有的基因在尿道中表达，该指标能鉴定出给定细胞类型的异常脱落。因此，需要有在肾病期间比其他基于尿液的测试能更早和更晚地准确评价肾状态的灵敏的方法和组合物。专利技术概述本专利技术提供新的组合物、系统和方法来诊断和控制肾相关疾病、病症以及相关指标。出于本专利技术的目的，术语“肾病(肾疾病)”和“肾异常(失调)”可互换，其意味着肾脏或其组成部分的结构或功能的任何疾病、紊乱、综合征、异常、病变或异常情况。本专利技术已经发现了一种鉴定仅在临床或科学上重要的尿道细胞中表达的特定基因的独特方法，具体是一种鉴定和监测肾病治疗的方法。通过检测通常不存在于尿液中、但在有影响这些细胞的肾脏疾病存在时而存在的肾细胞(足细胞或近端小管细胞)，就可以检测这些病症。在一个实施方案中，所述独特方法和组合物能通过检测肾小球足细胞和/或近端小管细胞的存在来确定肾脏疾病的开始以及监测足细胞和/或近端小管细胞对治疗的反应。在本专利技术中，这些细胞的存在是通过筛选一基因的表达来检测的，该基因仅仅存在于尿道中的特别感兴趣的细胞中(足细胞或近端小管细胞)。在另一实例中，本专利技术包括分析尿沉淀(urine sediment)细胞中表达的基因，然后在许多医学疾病和紊乱中提供非侵入性的迅速准确的分析肾状况和功能。在其他实例中，本专利技术包括分析自发脱落到尿液中的细胞中的基因表达，以便用非侵入性的基于尿液的测试来迅速诊断这些疾病和综合征。在一个实例中，基因表达的监测采用逆转录酶定量的聚合酶链反应(RT-QPCR)来独特地检测足细胞(通过在尿道中这些细胞内唯一表达的nephrin的表达)，和近端小管细胞(通过在尿道中这些细胞内唯一表达的Indian hedgehog的表达)。根据本专利技术，这些指标能在比变性蛋白尿早的疾病过程中显示出阳性。在另一实施方案中，本专利技术包括用于检测感兴趣细胞中的基因表达的新的引物和探针及其试剂盒。附图简述附图说明图1a和1b显示了TaqMan测定步骤的一个实例。图2显示了AmpliSensor测定步骤的一个实例。图3是本专利技术的一个非限制性实例的流程框图。较佳实施方案详述在一个非限制性实施方案中，本专利技术包括鉴别和分析一种或多种特定的基因序列，以标记出足细胞；以及鉴别和分析一个或多个其他特异性基因序列，从而标记出近端小管细胞。已知这两类细胞受许多肾病的影响，如仅作为例子的下列疾病。在本专利技术中，为了减少由于正常脱落进入尿液的其他细胞类型(如下部尿路细胞)的基因表达所引起的混淆，单独鉴别这些细胞类型中的基因表达。这些基因的鉴定取决于使用的灵敏方法。例如，使用灵敏度较低的方法，认为不会在某些细胞中表达的基因实际上也会以低水平(如已知在细胞中的基因表达水平的1％)表达。由于尿沉淀中的大多数细胞源自下部尿路细胞，这些细胞中的低水平转录干扰了检测上部尿路细胞的灵敏的RT-QPCR研究。相反，根据本专利技术，可以唯一地鉴定仅仅在感兴趣的上部尿路细胞中表达的基因，例如但不局限于，足细胞中的nephrin和近端小管细胞中的Indian hedgehog。例如，在疾病的较晚阶段，变性蛋白尿可以始终异常，因此，对于为防止足细胞损失而设计的治疗没有反应。此时，如果治疗有效地防止足细胞尿(podocyturia)，nephrin的RT-QPCR可以为正常，而变性蛋白尿测试则始终为异常，因为对足细胞的已有损伤不能被修复。本专利技术还包括鉴定具体疾病中的感兴趣细胞的脱落。在本专利技术中，我们出人意料地显示，正常的肾不会将足细胞或近端小管细胞释放到尿沉淀中。然而，涉及这些细胞的疾病或紊乱导致丧失足细胞或近端小管细胞进入尿沉淀中。这意味着至少一部分释放的细胞以完整细胞或细胞片段的方式存在，它们能旋转进入尿沉淀中。出于评定、诊断和治疗的目的，本专利技术鉴定这种脱落。本专利技术另一方面提供了与现有技术所见的那些不同的特异性探针。尽管以前的表达分析描述了潜在的探针候选物，但是没有人使用和RT-QPCR一样灵敏的技术，因此不能最终确定哪个是合适的标记。例如，根据灵敏度较低的表达研究，gleppl显示出其在尿道中仅在足细胞中表达，所以gleppl显示出有希望作为足细胞特异性标记的候选物。然而，本专利技术的RT-QPCR技术显示，除了预计到在足细胞中较大的合成外，下部尿路细胞中也有以前未检测到的较少量的gleppl转录。因此，gleppl基因的表达不适合作为足细胞的标记。这是因为下部尿路细胞中有低的有限的基因表达引起了混淆。相反，采用本专利技术，显示nephrin不在除足细胞外的尿路细胞中表达，因此其在尿沉淀中的存在可用作足细胞尿的替代标记。类似地，正常的尿沉淀中存在许多潜在的小管细胞的标记物，这表明这些基因在下部尿路细胞中有少量表达。甚至在用灵敏度较低的分析中显示仅在肾脏特定区域表达的候选基因(如N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶、水孔蛋白(aquaporin)1、尿调素(uromodulin)和SLC3A1)进行筛选时，也是如此。现已发现，Indian hedgehog是近端肾曲小管细胞和近端肾直小管细胞的合适标记。某些实例的灵敏RT-QPCR分析显示，在大量正常受试者的尿沉淀中，Indian hedgehog的水平不超过10-4(Indian hedgehog转录物的丰度/β-肌动蛋白转录物的丰度)。在一个非限制性实施方案中，本专利技术还包括用RT-QPCR分析尿沉淀中现存的核糖核酸(RNA)，以鉴别感兴趣的细胞。这需要至少一部分脱落进入尿沉淀的细胞有足够的完整性以产生RT-QPCR产物(这是以前未认识到的结果)。因此，出于本专利技术的目的，感兴趣的细胞可以被认为是足以提供完整RNA的全细胞或其片段。本专利技术还包括使遍在转录的管家基因表达，以确认能引导逆转录的RNA已被分离。在较佳的非限制性方案中，本专利技术包括，在足细胞和近端小管细胞所参与的疾本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测肾疾病的方法，该方法包括以下步骤：　　　　筛选哺乳动物尿液样品中一特定基因的表达，该特定基因只有在暗示肾疾病的细胞存在时才存在于所述尿液样品中，其中尿液样品中可检测的白蛋白浓度为０至３０ｍｇ／ｄｌ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DM库尔尼特，
申请(专利权)人：密执安州立大学董事会，
类型：发明
国别省市：US[美国]