一种肿瘤细胞药敏检测方法及其检测板技术

一种肿瘤细胞药敏检测方法及其检测板，属检测技术领域，用于解决目前检测中操作不标准、随意性大、不便检测的问题。其技术方案是，将检测分为预制检测板阶段和实验室检测阶段，预制检测板阶段是将抗肿瘤药物预先加入特制的检测板药检孔中，并予以冷冻固化，在检测时，将肿瘤细胞加入药检孔中，利用ＭＴＴ法还原成有色沉淀，再进而制成有色溶液，经酶标仪测定后计算比较，求得药敏数值，作出判断。本发明专利技术可以使检测方法标准化、商品化，极大地简化了操作程序，提高了检测的准确性和稳定性，减少化疗中的盲目性，指导临床科学合理地用药，提高化疗的有效率。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种对肿瘤细胞进行药物敏感检验的方法，属检测
2.化疗的抗药性抗药性是癌症化疗中无法回避的现实，研究表明，在化疗的不同阶段检测抗药性随时因时制宜采取不同对策，将大大提高化疗的水平。3.抗癌药物的选择与毒性避免，抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤正常的组织细胞，由于化疗的盲目性和抗药性，当医生试图通过大剂量、多药物、缩短疗程等方法改善疗效时，将会进一步加重毒性作用，使病人机体受到严重甚至是致命的损伤。药物敏感性的检测为可预见的化疗效果提供了重要依据，这无疑将会大大提高癌症的治疗水平。有鉴于此，对药物进行药敏检测是如此的必要和紧迫，促使专家们探索出多种检测方法，如集落形成法、放射性同位素前体掺入法、染料排斥法、流式细胞计法、鼠肾包膜下瘤移植法、MTT法等等，其中MTT法是备受推崇的方法。它操作简单、快速、结果重复性好、使用设备简单、成功率高。MTT法的原理是，凡有代谢活性的细胞核线粒体，其琥珀酸脱氢酶能脱下琥珀酸的氢原子，使之还原为延胡索酸，染料四甲基偶氮唑蓝作为氢原子的接收剂，能使可溶性黄色MTT还原为不可溶的有色沉淀甲瓒(fomazan)，在这种沉淀中加入二甲亚砜，经比色测定，即可计算药物的敏感度。MTT法的检测步骤是，处理标本→制备肿瘤细胞悬液(酶消化和物理分离等)→分离肿瘤细胞→肿瘤细胞计数→肿瘤细胞原代培养→加入抗癌药物→37℃CO2孵箱培养48小时→加MTT继续培养6-12小时→酶标仪比色→计算敏感度。以上步骤在实际操作中将显得非常繁琐而费时。在进行药物筛选时，每检测一次，都要重复一次上述步骤，若要检测60种抗癌药物，就要重复60次。而且，由于步骤多时间长，操作将必然会受到人为因素的干扰，假若检测人员在添加药物时，浓度或药量掌握不准，将直接形成误差，影响比色结果，而这是非常可能发生的。在药敏检测中，由于检测人员一般是先制备肿瘤细胞，而后将待测药物加入进行比色测定，这种操作在不同单位、不同测试人员、不同时段进行时，由于MTT法尚没有一个国际统一的技术标准支持，各科研机构和医疗部门采用的药物浓度、药物与细胞反应时间的确定及敏感标准的设立各不相同，这种误差就更是无法避免的。本专利技术的另一个目的是提供用于这种检测的检测板。本专利技术所述技术问题是由以下技术方案解决的一种肿瘤细胞药敏检测方法，它分为预制检测板阶段和实验室检测阶段，所述预制检测板阶段包含如下步骤A.准备检测板体选用每块板上含有多排、每排设有多个药检孔的实验板作检测板，要求检测板无破损、污染和划痕；B.消毒用环氧乙烷消毒；C.配制药物选择常用抗癌药物，分别配制药物溶液，浓度以下列公式计算浓度＝成人常规静脉用量/(成人标准体重×8％×1000)(％)；D.药物加入每孔加入药物溶液10微升，全部药检孔加完后，将检测板盖盖上，放入灭菌容器内；E.固化将装有检测板的容器放入冻干机内，真空冷冻4小时，将药检孔内的液体冻干成固体；F.包装将检测板封装在铝箔袋内，加入干燥剂；所述实验室检测阶段包含如下步骤G..标本留取外科手术切除肿瘤组织标本，取指尖大小，立即装入标本瓶内，若室温放置，应在2-6小时内检测完毕。H.标本预处理祛除标本周围的非肿瘤组织和坏死组织，用缓冲液冲洗2-3次，剪碎成粒径不大于1毫米的碎块；I.制备肿瘤细胞悬液将肿瘤组织碎块研磨过滤进入缓冲液溶液内，加入离心管内离心操作6-10分钟，弃去上清，用缓冲液混悬肿瘤细胞，再离心操作后弃去上清，将细胞混悬于DMEM培养基中，使细胞计数为5×105/ml。J.肿瘤细胞原代培养将检测板预温至37度，将DMEM培养基亦预温至37℃；每孔加细胞悬液200微升，轻轻摇荡混匀；37℃度、5％CO2孵箱内培养48小时；K.MTT还原每孔加入浓度为5mg/ml的MTT20μl，继续培养3-24小时，至形成蓝色针状结晶为止；L.检测将检测板离心操作8-10分钟，弃去上清，用吸水纸吸去残液；每孔加入二甲亚砜100微升，轻轻摇荡混匀；用酶标仪检测各孔OD值；M.计算与判断抑制率(IR)＝(1-给药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100％若IR＞50％，判定为高度敏感；30％≤IR≤50％，判定为敏感；IR＜30％，判定为不敏感。上述肿瘤细胞药敏检测方法，为防止标本凝固，在所述标本留取工序，加入抗凝剂，轻轻摇荡，使抗凝剂充分溶解，所述抗凝剂为肝素。上述肿瘤细胞药敏检测方法，为防止标本污染受损，在标本预处理工序，当标本用缓冲液冲洗后，再在4℃温度下用含青霉素和链霉素的DMEM培养基浸泡1-3小时。上述肿瘤细胞药敏检测方法，所述固化工序中真空度为102Pa，温度-20～-40℃。上述肿瘤细胞药敏检测方法，为便于观测，所述酶标仪的检测光的波长选定570nm。本专利技术要解决的另一个问题是用以下技术方案实现的一种肿瘤细胞药敏检测板，它由检测板体和板盖组成，所述检测板体平行设置多排药检孔，每排并列多个药检孔，药检孔为开口的圆筒状容器，药检孔中设有经过真空冷冻干燥固化的药膜；所述板盖为条状板，四周设有边框。上述肿瘤细胞药敏检测板，所述药检孔设置4-8排，每排设置检测药检孔8-12个。上述肿瘤细胞药敏检测板，所述盖板的边框与条状板交界处均匀设置微型凸起。上述肿瘤细胞药敏检测板，所述检测板体为分体结构，各排药检孔连体制作在一起，多排药检孔再嵌镶在框架内。按照本专利技术提供的检测方法，可以对体外原代培养的肿瘤细胞进行药物敏感检测，这种检测将传统的先加细胞后加药物检测改为先加药物、后加细胞检测，从而将药物包被从实验室的检测现场转移至工厂预制，这种改变看似简单，实则带来根本性的变革，它把现场极易随意发生的操作，统一成一种易于标准化的操作模式，即，将检测常用的药物预先加入到检测板体的药检孔中、经真空冷冻干燥等工艺处理，制成商品化的标准检测板，再以此板为基础，提供给各单位进行药物敏感性检测，将一个以往全部在实验室完成的操作分解成两个阶段，一段为工厂的预制检测板阶段，一段为实验室的检测阶段，这种变革的优点是1.延长药物的储存期；2.便于检测方法的标准化和商品化；3.极大地简化了操作程序，提高了检测的准确性和稳定性；4.由于操作简单、成本降低，从而有利于抗癌药物试验的开展和普及，减少化疗中的盲目性，指导临床合理用药，提高化疗有效率。图3是图2的剖视图；图4是板盖的主视图；图5是板盖的后视图。常用的抗癌药物有阿霉素(缩写为ADM，下同)、顺铂(COOP)、环磷酰胺(CTX)、氟脲嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)等60余种，包被这些药物时，按下述工序进行抗癌药物的准备药物浓度按成人常规静脉用量计算。抗癌药检常规浓度＝成人常规静脉用量/(成人标准体重×8％×1000)其中成人标准体重按60KG计算，细胞外液按8％计算，常规浓度稀释10倍为试验用浓度。药物配制按各药物的有关说明进行，以阿霉素为例，规格为10mg、浓度为20μg/ml，配置方法为溶于10ml水(1mg/ml)中，再取0.2ml加水至10ml即成。其它药物与此雷同。按常规紫外线消毒法消毒无菌间和洁净工作台，整个操作在无菌间洁净工作台内进行。将筛选后的检测板进行消毒，消毒采用环氧乙烷柜室法，还氧乙烷用量1kg/m3；在相对湿度60-80％情况下，作用6-10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤细胞药敏检测方法，其特征在于，它分为预制检测板阶段和实验室检测阶段，所述预制检测板阶段包含如下步骤： Ａ．准备检测板：选用每块板上含有多排、每排设有多个药检孔的实验板作检测板，要求检测板无破损、污染和划痕； Ｂ．消毒：用环氧乙烷消毒； Ｃ．配置药物：选择常用抗癌药物，分别配置药物溶液，浓度以下列公式计算： 浓度＝成人常规静脉用量／（成人标准体重×８％×１０００）（％）； Ｄ．药物加入：每孔加入药物溶液１０微升，全部药检孔加完后，将检测板盖盖上，放入灭菌容器内； Ｅ．固化：将装有检测板的容器放入冻干机内，真空冷冻４小时，将药检孔内的液体冻干成固体； Ｆ．包装：将检测板封装在铝箔袋内，加入干燥剂； 所述实验室检测阶段包含如下步骤： Ｇ．标本留取 外科手术切除肿瘤组织标本，取指尖大小，立即装入标本瓶内，若室温放置，应在２－６小时内检测完毕。 Ｈ．标本预处理：祛除标本周围的非肿瘤组织和坏死组织，用缓冲液冲洗２－３次，剪碎成粒径不大于１毫米的碎块； Ｉ．制备肿瘤细胞悬液： 将肿瘤组织碎块研磨过滤进入缓冲液溶液内，加入离心管内离心操作６－１０分钟，弃去上清，用缓冲液混悬肿瘤细胞，再离心操作后弃去上清，将细胞混悬于ＤＭＥＭ培养基中，使细胞计数为５×１０↑［５］／ｍｌ Ｊ．肿瘤细胞原代培养： 将检测板预温至３７℃，将ＤＭＥＭ培养基亦预温至３７℃； 每孔加细胞悬液２００微升，轻轻摇荡混匀； ３７℃度、５％ＣＯ２孵箱内培养４８小时； Ｋ．ＭＴＴ还原 每孔加入浓度为５ｍｇ／ｍｌ的ＭＴＴ２０μｌ，继续培养３－２４小时，至形成蓝色针状结晶为止； Ｌ．检测： 将检测板离心操作８－１０分钟，弃去上清，用吸水纸吸去残液； 每孔加入二甲亚砜１００微升，轻轻摇荡混匀； 用酶标仪检测各孔ＯＤ值； Ｍ．计算与判断： 抑制率（ＩＲ）＝（１－给药孔平均ＯＤ值／对照孔平均ＯＤ值）×１００％ 若：ＩＲ＞５０％，判定为高度敏感； ３０％≤ＩＲ≤５０％，判定为敏感； ＩＲ＜３０％，判定为不敏感。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：崔克勤，
申请(专利权)人：崔克勤，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]