葡萄糖脱氢酶和生产该脱氢酶的方法技术

在培养基中培养伯克霍尔德氏菌属并具有产生葡萄糖脱氢酶能力的微生物，并且从培养基和／或微生物细胞中收集葡萄糖脱氢酶，能得到新颖的葡萄糖脱氢酶，它是具有高底物特异性的酶，生产成本低，不受测试样本中溶解氧的任何影响，具有特别高的热稳定性。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新颖的葡萄糖脱氢酶和生产该酶的方法、编码该酶的DNA、包含编码该酶的DNA的重组载体、用该重组载体转化的转化体、产生该酶的新微生物、使用包括该酶、转化体或微生物的酶电极的葡萄糖传感器、和葡萄糖测定试剂盒。
技术介绍
使用与特定底物特异性反应的酶的生物传感器在各种工业领域处于活跃的发展中。至于葡萄糖传感器，它是生物传感器的一种，具体而言，测量方法和利用这类方法的装置主要在医药领域处于活跃的发展中。自从Clark和Lyonas于1962年首先报道了包含葡萄糖氧化酶与氧电极组合的生物传感器，葡萄糖传感器已有约40年的历史(L.C.Clark，J.和Lyonas，C.“Electrode systems for continuous monitoring incardiovascular surgery.”Ann.N.Y.Acad.Sci.，10520-45)。因而，采纳葡萄糖氧化酶作为葡萄糖传感器的酶已有很长的历史。这是因为葡萄糖氧化酶显示很高的葡萄糖底物特异性和优良的热稳定性，这种酶进一步能够被大规模生产，它的生产成本低于其他酶。底物特异性高意味着这种酶不与除葡萄糖以外的其他糖反应，这便产生这样一个优点，能够实现精确的测量，测量值没有误差。进而，热稳定性优良意味着能够防止关于热使酶变性和其酶活性失活的问题，这便产生这样一个优点，能够在长时间阶段内进行精确的测量。不过，尽管葡萄糖氧化酶具有高底物特异性和优良的热稳定性，并且能够在低成本下生产，仍然面临这样一个问题，该酶受溶解氧的影响，如下所述，这会影响测量结果。同时，除了葡萄糖氧化酶以外，利用葡萄糖脱氢酶的葡萄糖传感器也已得到发展。这种酶也在微生物中被发现。例如，存在已知得自杆菌属的葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)和得自隐球菌属的葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.119)。前者葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)是催化β-D-葡萄糖+NAD(P)+D-δ-葡糖酸内酯+NAD(P)H+H+反应的酶，后者葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.119)是催化D-葡萄糖+NADP+D-δ-葡糖酸内酯+NADPH+H+反应的酶。上述得自微生物的葡萄糖脱氢酶已有市售。这些葡萄糖脱氢酶具有这样一个优点，它们不受溶解在测量样本中的氧的影响。这便产生这样一个优点，能够实现精确的测量，不会导致测量结果的误差，即使测量是在氧分压低的环境中测量的或者使用需要大量氧的高浓度样本进行测量也是如此。不过，尽管葡萄糖脱氢酶不受溶解氧的影响，仍然面临热稳定性差和底物特异性弱于葡萄糖氧化酶的问题。因此，需要克服葡萄糖氧化酶和葡萄糖脱氢酶的缺点的酶。本专利技术的专利技术人报道了他们关于使用从温泉附近的土壤收集的样本研究葡萄糖脱氢酶的结果Sode K.，Tsugawa W.，Yamazaki T.，Watanabe M.，Ogasawara N.和Tanaka M.，Enzyme Microb.Technol.，19，82-85(1996)；Yamazaki T.，Tsugawa W.和Sode K.，Appli.Biochemi.and Biotec.，77-79/0325(1999)；Yamazaki T.，TsugawaW.和Sode K.，Biotec.Lett.，21，199-202(1999)。不过，在这些研究的阶段尚未鉴别具有生产酶的能力的细菌菌株。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供克服已知葡萄糖氧化酶和葡萄糖脱氢酶的缺点的酶，也就是这样一种酶，它显示高的底物特异性和优良的热稳定性，能够在低成本下生产，并且不受溶解在测量样本中的氧的影响。进而，本专利技术的另一目的是提供生产上述酶的方法、利用该酶特征的蛋白质和产生该酶的新微生物。本专利技术的另一目的是提供编码上述酶的DNA、含有编码该酶的DNA的重组载体和用该重组载体转化的转化体。本专利技术的另一目的是提供使用包括上述酶、转化体或微生物的酶电极的葡萄糖传感器和包括上述酶的葡萄糖测定试剂盒。本专利技术的专利技术人成功地从温泉附近的土壤中分离了洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkhorderia cepacia)，它产生实现上述目的的酶，从而完成了本专利技术。因而，本专利技术提供下列各项。(1)生产葡萄糖脱氢酶的方法，包括下列步骤在培养基中培养具有葡萄糖脱氢酶产生能力的伯克霍尔德氏菌属微生物，从培养基和/或微生物细胞中收集葡萄糖脱氢酶。(2)根据(1)的生产葡萄糖脱氢酶的方法，其中该微生物是洋葱伯克霍尔德氏菌。(3)根据(1)或(2)的生产葡萄糖脱氢酶的方法，其中该葡萄糖脱氢酶具有下列性质(i)该酶具有催化葡萄糖脱氢反应的作用；(ii)该酶由这样的亚单位组成，它们在还原条件下、在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示约60kDa的分子量和约43kDa的分子量；(iii)该酶在使用TSK Gel G3000SW(Tosoh公司)的凝胶过滤色谱中显示约380kDa的分子量；和(iv)该酶显示45℃左右的最佳反应温度(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。(4)根据(3)的生产葡萄糖脱氢酶的方法，其中显示约43kDa分子量的亚单位是一种电子转移蛋白。(5)根据(4)的生产葡萄糖脱氢酶的方法，其中该电子转移蛋白是细胞色素C。(6)葡萄糖脱氢酶，它能够被伯克霍尔德氏菌属微生物产生。(7)根据(6)的葡萄糖脱氢酶，其中该微生物是洋葱伯克霍尔德氏菌。(8)根据(6)或(7)的葡萄糖脱氢酶，其中该葡萄糖脱氢酶具有下列性质(i)该酶具有催化葡萄糖脱氢反应的作用；(ii)该酶由这样的亚单位组成，它们在还原条件下、在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示约60kDa的分子量和约43kDa的分子量；(iii)该酶在使用TSK Gel G3000SW(Tosoh公司)的凝胶过滤色谱中显示约380kDa的分子量；和(iv)该酶显示45℃左右的最佳反应温度(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。(9)根据(8)的葡萄糖脱氢酶，其中显示约43kDa分子量的亚单位是一种电子转移蛋白。(10)根据(9)的葡萄糖脱氢酶，其中该电子转移蛋白是细胞色素C。(11)根据(8)至(10)任意一项的葡萄糖脱氢酶，其中显示约60kDa分子量的亚单位包含SEQ ID NO3中第2至12氨基酸的氨基酸序列。(12)根据(8)至(11)任意一项的葡萄糖脱氢酶，其中显示43kDa分子量的亚单位的N-末端具有SEQ ID NO5的氨基酸序列。(13)根据(11)的葡萄糖脱氢酶，其中显示约60kDa分子量的亚单位是如下列(A)或(B)所定义的蛋白质(A)具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白质；(B)具有包括一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO3的氨基酸序列和葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。(14)根据(6)的葡萄糖脱氢酶，它在45℃左右和75℃左右显示活性峰。(15)细胞色素C，它是根据(10)的葡萄糖脱氢酶的亚单位，并且具有SEQ ID NO5的氨基酸序列。(16)DNA，它编码根据(15)的细胞色素C的一部分，并且具有SEQ IDNO8的核苷酸序列。(17)DNA，它编码根据(15)的细胞色素C的一部分，并且具有SEQ IDNO1核苷酸序列中第2386至2467核苷酸的核苷酸序列。(18)DNA，本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产葡萄糖脱氢酶的方法，包括下列步骤：在培养基中培养具有葡萄糖脱氢酶产生能力的伯克霍尔德氏菌属微生物，从培养基和／或微生物细胞中收集葡萄糖脱氢酶。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：早出广司，
申请(专利权)人：早出广司，
类型：发明
国别省市：JP[日本]