本发明专利技术属于中药鉴定技术领域，是用于鉴定伊贝母分子鉴定方法。发明专利技术方法设计的伊贝母聚合酶链反应的鉴定引物ＤＮＡ序列为：ＦｐｄＰａ：５′－ＡＣＣＧＴＧＴＴＣＡＣＧＡＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧ－３′，ＦｐｄＰｂ：５′－ＴＣＣＧＧＧＴＣＴＣＴＴＧＡＧＣＣＣＣＴＴＧ－３。伊贝母的聚合酶链反应－限制性酶切图谱分子鉴定方法（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）所用的ＰＣＲ扩增引物序列为：ＩＴＳ－Ｐ１：５’－ＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡ－３’，ＩＴＳ－Ｐ３：５’－ＧＣＴＡＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴ－３’；伊贝母的特征ＤＮＡ碱基序列为：５’－ＴＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＧＣＴＣＣＧＧＡＣＡＣＧＧ－３’；限制性内切酶Ｅｃｏ８１Ｉ及其同切酶可识别并切割该序列。本发明专利技术能够实现伊贝母的快速、准确地鉴别。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及中药材种质的品质鉴定
技术介绍
中药伊贝母为百合科植物伊犁贝母Fritillaria pallidiflora Schrenk的干燥鳞茎，具有清肺、化痰、散结之功效，用于肺热咳嗽，胸闷痰粘，瘰疬，痈肿等症的治疗。伊贝母疗效好，生物碱含量高，毒性低，具有很好的市场前景。目前，除原产地新疆外，伊贝母在我国北方部分省份的引种栽培已获得成功。由于伊贝母毒性低，市场价格较高，为防止用毒性较高的其它种类贝母冒充伊贝母的不良市场行为，需要寻找可靠的将伊贝母与其它贝母相区别的鉴别方法。然而，用通常的型态及显微等鉴定方法难以将伊贝母与其它种类的贝母区别开来。通过比较各种贝母的一段DNA的碱基序列，找到了伊贝母与其它种类贝母DNA序列的差别，这种差别可通过以下两种方法加以区别(1)鉴别性PCR鉴别方法；(2)聚合酶链反应(PCR)与限制性内切酶反应的片段多态性(RFLP)鉴别方法。但这两种鉴别对于不同的物种，其所用的引物、限制性内切酶的种类及鉴别方法都不相同。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供二种准确鉴别伊贝母的鉴别性PCR分子鉴定方法(方法1)、PCR-RFLP分子鉴定方法(方法2)，方法1包括伊贝母的特征DNA碱基序列、一对通用PCR引物、一对鉴别性PCR引物及其鉴定方法。方法2包括伊贝母的特征DNA碱基序列、一对PCR引物、一种限制性内切酶酶切位点及其鉴定方法。本专利技术的技术方案如下首先从各药材中提取总DNA，然后利用方法1或方法2进行鉴别。方法1本专利技术设计的伊贝母聚合酶链反应的鉴定引物DNA序列为引物1FpdPa5′-ACC GTG TTC ACG ATT GCC TCA GG-3′ 引物2FpdPb5′-TCC GGG TCT CTT GAG CCC CTT G-3用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即可得到鉴定引物的白色粉未结晶。中药材伊贝母聚合酶链反应鉴定的方法为(1)药材DNA提取按常规进行，用无离子水将供试品DNA模板浓度调节至0.2～0.5μg/μL。(2)模板DNA质量的鉴定用另一对通用引物鉴别模板DNA的质量，该对引物可扩增各种植物的nrDNAITS区序列。引物的DNA序列为ITS-P15’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，ITS-P25’-TTA TTG ATA TGC TTA AAC TCAGCG GG-3’(Takaiwa F，Oono K，Sugiura M.Nucleotide sequence of the 17S-25Sspacer region from rice rDNA.Plant Mol Biol，1985，4355-364)；引物浓度为30pmol/μl，除将反应体系中引物1、引物2改为ITS-P1、ITS-P2外，其它各物品用量同(3)；除复性温度改为53℃外，扩增反应条件同(4)；电泳分析同(5)。若得到阳性扩增，则表明模板合格，可进行后续步骤的检验；若无扩增条带，则需改进DNA提取条件，待获得合格的模板后再进行后续步骤的检验。(3)鉴别性PCR引物用无离子水溶解并稀释至30pmol/μL。以反应体系均以30μL为参考点，各物品的用量为10×TaqDNA聚合酶缓冲液3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(10mM)0.6μl引物1、引物2各0.5μlTaq DNA聚合酶 1.0～2.0单位供试品DNA模板 1.0～2.0μl无离子水 加到30μl(4)PCR循环在PCR仪上，95℃予变性2～4min，然后按下列参数进入30循环变性95℃ 20～40秒复性67～72℃ 20～40秒延伸72℃ 20～40秒循环结束后在72℃保持2～4分钟补齐。(5)电泳观察取出PCR反应液4μl与加样缓冲液1μl混合，2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭，即EB)检测扩增结果。如总的反应体积不为30μl，反应物品的用量以30μl反应剂量的比例为参考点，相应地增加或减少。若有阳性扩增，则供试品为伊贝母；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为伊贝母。方法2利用一对引物，用PCR方法扩增一段DNA片段，该片段中伊贝母的特征DNA碱基序列为5’-TTCGCGATTG CCTCAGGGCG CTCCGGACAC GG-3’，针对伊贝母与其它种贝母DNA序列的差异，选择合适的DNA限制性内切酶酶切位点，通过分析聚合酶链反应产物的限制酶切图谱差异，达到快速、准确鉴别伊贝母目的。对需要鉴定的贝母样品，提取其总DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物(ITS-P1、ITS-P3)进行PCR扩增，供试品能够扩增出一段DNA片段；用限制性内切酶Eco81 I或其同切酶对供试品的PCR扩增产物进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，伊贝母会出现126，178bp的条带，而其它种类的贝母不出现上述两条带。当供试样品经用本法进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶酶切后，经琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小，便可准确地鉴定伊贝母或非伊贝母药材。本专利技术设计的用于鉴别伊贝母PCR-RFLP分子鉴定方法是采用以下步骤(1)药材DNA的提取按常规进行，用无离子水将供试样品的DNA浓度调节至0.2～0.5μg/μl；(2)扩增DNA片段，即进行聚合酶链反应，用于聚合酶链反应的一对引物的DNA序列为ITS-P15’-CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’ITS-P35’-GCT ACG TTC TTC ATC GAT-3’(3)PCR扩增产物中加入限制性内切酶Eco81 I或其同切酶进行酶切，限制性内切酶Eco81 I或其同切酶的酶切位点为CCTNAGG；(4)琼脂糖凝胶电泳分析；(5)鉴定结果的判断，若出现126，178bp条带则供试品为伊贝母。本专利技术的效果是可解决伊贝母与其它种贝母相区别的鉴定难题，方法1提供伊贝母的特征DNA碱基序列、一对通用PCR引物、一对鉴别性PCR引物及其鉴定方法；方法2提供鉴定所需的一对PCR引物、PCR反应条件、伊贝母的特征DNA碱基序列、一种限制性内切酶。与伊贝母相比，其它种类的贝母所含的有效成分有明显差别，伊贝母毒性小，因此市场上伊贝母的价格较高。然而，伊贝母与其它种贝母难以通过形态、显微等特征来加以区别，因此，需要找到一种可靠的鉴别方法。本专利技术利用伊贝母与其它种贝母药材DNA序列的差异，建立了快速、便捷、可靠的鉴别性PCR及PCR-RFLP鉴别方法，对于保证伊贝母的药材质量，打击假冒伊贝母的市场行为具有重要的价值。具体实施例方式方法1首先从贝母类药材不同种的原植物中提取总DNA，用PCR方法扩增多个基因片段并分别纯化，对各纯化片段进行DNA序列分析，建立伊贝母及其近缘种、混淆种的DNA序列数据库，在比较数据库的基础上，选择合适的DNA片段，针对药材伪、混品出现的情况，设计一对鉴别性PCR引物引物1FpdPa5′-ACC GTG TTC ACG ATT GCC TCA GG-3′引物2FpdPb5′-TCC GGG TCT CTT GAG CCC CTT G-3用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即可得到鉴定引物的白色粉未结晶。采本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种中药伊贝母聚合酶链反应鉴定引物，其特征在于：鉴定引物ＤＮＡ序列为：ＦｐｄＰａ：５′－ＡＣＣＧＴＧＴＴＣＡＣＧＡＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧ－３′，ＦｐｄＰｂ：５′－ＴＣＣＧＧＧＴＣＴＣＴＴＧＡＧＣ ＣＣＣＴＴＧ－３，用全自动ＤＮＡ合成仪按上述鉴定引物的ＤＮＡ序列进行合成，即得到鉴定引物的白色粉末结晶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李萍，王冲之，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。