提供了使用核酸准备纳规模反应的方法。核酸被可饱和而可逆地捕获在反应室、通常为毛细管的内部表面上。除去过量核酸，在毛细管内直接进行反应。或者，将可饱和结合的核酸洗脱，分配计量的核酸，用于随后在独立的反应室内的反应。还提供了用于进行本发明专利技术方法的装置和设计用来有利地利用该方法进行高通量核酸测序反应的系统。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，涉及准备和进行小规模反应的方法和装置，特别是使用核酸模板的小规模循环反应与等温反应。
技术介绍
由联邦政府提供资金支持的人类基因组计划的最初目的是在2005年以前按十倍覆盖度完成人基因组序列。由于步伐有戏剧性加快，最近已经提出了部分草稿。不过，在人类基因组计划完成之后，对迅速、廉价的DNA测序的需求将戏剧性地增长而不是减少。例如，非人类生物基因组的测序逐渐受到关注，包括细菌、植物和动物。更重要的是，急速增长的分子病理学与药物基因组学(pharmacogenomics)领域将需要对个别患者进行多基因测序。分子病理学涉及通过鉴别特定基因的突变诊断人类疾病，经常是一种预后制剂。药物基因组学涉及了解存在于所有人群中的等位差异如何影响个体对药物的治疗反应和对副作用的敏感性。随着对个别患者基因测序的需求的增长，对测序能力的要求也将如此。需求将从仅存在于得到充裕资金支持的学术研究中心与基因组公司中的大型、集中式、高通量的DNA测序设施转移为能够安装在多数医院与诊所的小型、不太复杂、中等通量的基因测序系统。市场上对这种测序技术的转移将鼓励减少试剂成本并且使样本加工步骤尽可能简单与连贯。在二十世纪七十年代后期，Sanger等人开发了用于DNA序列分析的酶链终止方法，该方法生产DNA片段的嵌套集合，它们在遍及序列各处的每个核苷酸上具有普通的起始点和随机的终止点。LloydSmith、Lee Hood和其他人修正了Sanger的方法，在测序反应中使用四种荧光标记物，能够进行单谱带分离。这导致第一代自动DNA测序仪的诞生，它们使用聚丙烯酰胺平板凝胶进行分离。最近，荧光能量-转移染剂已经用于制备染剂组合，它们使信号增强2至10倍，并且简化光学构造。自动荧光毛细管阵列电泳(CAE)DNA测序仪似乎是代替平板凝胶的一致性技术。毛细管凝胶电泳加速测序产物的分离，具有戏剧性减少样本体积需要的潜力。96通道式毛细管电泳仪MegaBACETM在商业上可从Molecular Dynamics(Sunnyvale，CA)获得，采用激光诱导荧光(LIF)聚焦荧光扫描仪，在90分钟内每支毛细管检测平均约625个碱基，循环时间为两小时。聚焦空间滤波导致信噪比更高，因为在用光电倍增管(PMT)进行信号检测之前消除了来自周围材料的多余反射和荧光。因此，每条测序谱带可以获得亚原子摩尔(subattomole)水平的敏感度。聚焦成像对采用毛细管电泳的微片分析系统来说也是特别重要的，其中玻璃或塑料微片的背景荧光可以大大高于熔融石英毛细管的。毛细管阵列电泳系统将满足基因组学界最初对DNA分析的很多通量需求。不过，这种小体积样本制备方法仍然显著妨碍了提高通量和降低成本。尽管荧光DNA测序仪提高了DNA序列获取的通量，不过它们也把通量的瓶颈从序列获取转移回到样本制备上。响应于此，已经开发了用于制备测序模板和转座子促进的DNA测序的快速方法，同磁珠捕获方法一样取消了离心。已经筛选了嗜热性Archae DNA聚合酶，并进行了遗传工程加工，以提高逼真度，确保高温下的稳定性，延长长度，改变对二脱氧核苷酸和荧光类似物的亲合性。这些改进已经降低试剂成本，简化样本制备，提高数据精度，增加可读长度。测序学界还已经开发了更高通量的方法，用于制备DNA模板、聚合酶链反应(PCR)反应和DNA测序反应。利用96与384孔微量滴定板、多通道移液器和实验室机器人工作站，样本制备已经逐渐多样化和自动化。一般来说，这些工作站模拟技术人员所进行的操作，具有最小的工作体积，约一微升，即使独立式多通道移液器用于操作更小体积也是如此。关于在毛细管系统上进行DNA鸟枪式测序的典型原尺寸样本制备方法开始于溶解噬菌体噬斑或细菌集落，以分离亚克隆的DNA。在有些情况下，可能需要PCR扩增亚克隆的DNA插入片段，使其在样本中的浓度呈指数增加。接着，加入外切核酸酶I(ExoI)和北极虾碱性磷酸酶(SAP)，进行酶清除反应，以除去干扰循环测序的引物和过量dNTP。ExoI用于降解单链引物为dNMP，但不消化双链产物。SAP转化dNTP为dNP，将dNTP浓度从用于PCR反应的200μM减少至用于荧光测序的小于0.1μM。反应是在37℃下进行的，然后加热至65℃，不可逆地使ExoI和SAP变性。因为PCR扩增能够生产过量的循环测序用模板DNA，所以可以在循环测序之前将ExoI/SAP处理过的PCR样本稀释五倍。这减少污染物的浓度至导致较少干扰毛细管电泳分析的范围内。加入循环测序试剂，通常为具有荧光标记染剂的引物或终止子，使反应进行热循环，驱动所标记片段的线性扩增。最后，循环后，对样本进行后期加工，通常为乙醇沉淀或旋转过滤，重新悬浮在甲酰胺、另一种变性剂或水中，将样本电动注射至毛细管电泳系统中。这种工作流程导致MegaBACETM系统性能的戏剧性提高，相似的工作流程目前似乎也是选择其他毛细管电泳系统的方法。采用来自人基因组随机亚克隆体或表达序列标记(EST)的单一噬斑与集落的真实样本，这种以线性聚丙烯酰胺为分离基质的工作流程已将200个碱基对以上的样本的成功率从约60％提高至85-90％，已将平均可读长度从约400提高至大于600个碱基。此外，还已证实这种方法是相当稳健的。尽管上述样本制备方法已经大大增加了通量，不过试剂成本仍占测序成本的大部分。毛细管电泳仅需要亚原子摩尔的样本，但是目前样本是按皮摩尔范围制备的。减少反应体积将因此降低DNA测序成本，仍可提供足够的分析材料。不过，反应体积的实质性减少仅在这样的情形中才能实现，即能够开发令人满意的方法，用于操作样本和试剂并使它们反应。理想的是，这样一种方法将是自动化的，一次生产多份样本。而且，这样一种方法整合为一种模块将是可取的，能够与另外的组分衔接，例如毛细管电泳与检测器，用于分离和分析。已经设计了若干种装置，以帮助实现样本制备的自动化。例如，美国专利No.5,720,923描述了这样一种系统，其中小循环反应发生在直径小至1mm的试管内。随后使试管受到由热传导部件所产生的热循环，以进行所需反应。在单一试管内可以加工多份样本，即抽取少量样本，各自被不与样本混合的液体分离在试管内。借助泵使流体沿试管移动。这些特征结合在这样一种系统中，它自动地清洁试管，移动含有带样本小孔的样本托盘，使试管与样本托盘中的小孔接触。美国专利No.5,785,926公开了用于传送少量样本的系统。在这种系统中，至少一支毛细管用于传送少量样本。与计算机控制马达连接的精确线性传动装置充当气压活塞，用试管等分和分散液体。用光传感器监测样本量，它检测毛细管节段内液体的存在。系统包括含有待沉积液体的流体站和用于定位传送毛细管的定位装置。美国专利No.5,897,842公开了利用热循环自动化样本制备的系统。在这种系统中，将反应混合物用泵注入毛细管。试管的一端用来自联合泵的压力密封，另一端用压在试管上的阻挡层密封。泵也起到在试管内移动流体的作用。一旦两端被密封，使试管受到热循环。在这种系统中，机器人转移装置移动样本制备站和热循环站之间的试管，在样本制备站中泵将反应混合物组分加载到试管中。在上面所讨论的系统中，有必要首先将样本、例如测序用DNA模板与试剂混合在一起，然后将本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种使用归一化量的ＤＮＡ在毛细管中进行酶反应的方法，包括：向毛细管中引入酶反应混合物，其中所述毛细管具有归一化量的ＤＮＡ，其中所述反应混合物含有寡核苷酸引物、ＤＮＡ聚合酶和脱氧核苷三磷酸（ｄＮＴＰｓ），其中，通过使所 述毛细管内表面与含有ＤＮＡ和离液剂的溶液接触一段足以使所述ＤＮＡ饱和结合至所述内表面的时间，而使得所述ＤＮＡ从过量ＤＮＡ中直接饱和结合至所述内表面；以及从其中除去所述过量ＤＮＡ；以及用所述归一化量的ＤＮＡ在所述毛细管中进行所 述酶反应。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：A哈德，S乔瓦诺维克，
申请(专利权)人：阿莫萨姆生物科学SV公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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