1,4‑二恶烷降解菌检测用引物组及1,4‑二恶烷降解菌的检测·定量方法技术

本发明专利技术的课题在于提供能够迅速且高精度地进行1,4‑二恶烷降解菌的检测·定量的引物。具体而言，在于提供如下引物组，其由包含序列号：1记载的碱基序列的引物及包含序列号：2记载的碱基序列的引物构成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】1,4-二恶烷降解菌检测用引物组及1,4-二恶烷降解菌的检测·定量方法
本专利技术涉及用于聚合酶链式反应(以下称为PCR)的引物组以及利用该引物组检测·定量1,4-二恶烷降解菌的方法。
技术介绍
1,4-二恶烷是下式(1)所表示的环状醚。1,4-二恶烷与水、有机溶剂的相溶性优异，主要作为有机合成的反应溶剂来使用。2010年度日本的1,4-二恶烷的制造·进口量约4500t/年，推测有约300t/年被排放到环境中。由于1,4-二恶烷为水溶性，如被排放到水环境中则会大范围扩散。另外，由于挥发性、对固体的吸附性、光降解性、水解性、生物降解性均低，故而难以从水中除去。由于1,4-二恶烷除具有急性毒性及慢性毒性之外，还被指出有致癌性，所以担心1,4-二恶烷引起的水环境的污染会对人及动植物造成不良影响。因此，在日本通过自来水水质标准(0.05mg/L以下)、环境标准(0.05mg/L以下)及排水标准(0.5mg/L以下)对1,4-二恶烷进行了规定。通过以往的活性污泥法或活性碳吸附法等的处理方法，无法从水中充分除去1,4-二恶烷。只有通过添加过氧化氢的臭氧处理(O3/H2O2)、在紫外线照射下的臭氧处理(O3/UV)、在放射线或超声波照射下的臭氧处理等合用了多种物理化学氧化方法的促进氧化法被确认具有1,4-二恶烷处理的有效性。然而，由于促进氧化法的起始成本及运营成本高而没有普及。另外，在非专利文献1中报道了存在1,4-二恶烷以外的有机物时，通过促进氧化法的1,4-二恶烷的处理效率降低。寻求低成本且能稳定地处理包含1,4-二恶烷的水的方法，在专利文献1、非专利文献2中提出了通过1,4-二恶烷降解菌进行生物处理。生物处理是将1,4-二恶烷降解菌投入于曝气槽、土壤、地下水等，并降解其所包含的1,4-二恶烷的方法。然而，1,4-二恶烷降解菌的菌体量天天都在变动。由于1,4-二恶烷降解菌减少时处理能力会降低，所以有必要掌握1,4-二恶烷降解菌的菌体量，且在菌体量少时就追加。作为掌握菌体量的方法，可列举将包含1,4-二恶烷降解菌的样品用琼脂平板培养基培养并于数日后以目视对菌落数进行计数的方法。然而，存在如下问题：培养耗时，进一步形成的菌落不能确定是1,4-二恶烷降解菌还是其他的菌。1,4-二恶烷降解菌可大致分为以下2种：可将1,4-二恶烷作为唯一碳源进行降解及同化的菌；及在四氢呋喃等其他成分的存在下通过共代谢反应进行1,4-二恶烷的降解的菌。非专利文献3、4中报道了上述1,4-二恶烷降解菌所具有的THF单加氧酶参与1,4-二恶烷的降解。THF单加氧酶是分类于承担多种烃类的初始氧化的可溶性铁(II)单加氧酶(SDIMO)的一种，SDIMO中另外还包括甲烷/丙烷单加氧酶等(非专利文献5)。另外，在非专利文献6中报道了具有THF单加氧酶以外的SDIMO的菌也有降解1,4-二恶烷的可能性。专利文献1：日本特开2008-306939号公报非专利文献1：K.KOSAKA,H.YAMADA,S.MATSUI,andK.SHISHIDA:Theeffectsoftheco-existingcompoundsonthedecompositionofmicropollutantsusingtheozone/hydrogenperoxideprocess.WaterSci.Technol.,42,pp.353-361,2000.非专利文献2：清和成，池道彦：使用1,4-二恶烷降解菌的污染地下水的生物处理·净化技术的可能性，使用水及废水，Vol.53,No.7,2011.非专利文献3：H.MASUDA,K.McCLAY,R.J.STEFFAN,andG.J.ZYLSTRA:Biodegradationoftetrahydrofuranand1,4-dioxanebysolublediironmonooxygenaseinPseudonocardiasp.strainENV478.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.22(5),pp.312-316,2012.非专利文献4：A.GROSTERN,C.M.SALES,W.-Q.ZHUANG,O.ERBILGIN,andL.ALVAREZ-COHEN:Glyoxylatemetabolismisakeyfeatureofthemetabolicdegradationof1,4-dioxanebyPseudonocardiadioxanivoransstrainCB1190.Appl.Environ.Microbiol.,78(9),pp.3298-3308,2012.非专利文献5：N.V.COLEMAN,N.B.BUI,andA.J.HOLMES:Solubledi-ironmonooxygenasegenediversityinsoils,sedimentsandethaneenrichments.Environ.Microbiol.,8(7),pp.1228-1239,2006.非专利文献6：S.MAHENDRA,andL.ALVAREZ-COHEN:Kineticsof1,4-dioxanebiodegradationbymonooxygenase-expressingbacteria.Environ.Sci.Technol.,40(17),pp.5435-5442,2006.
技术实现思路
本专利技术的课题在于提供能够迅速且高精度地进行1,4-二恶烷降解菌的检测·定量的引物。1.一种引物组，其特征在于，由包含序列号：1记载的碱基序列的引物及包含序列号：2记载的碱基序列的引物构成。2.一种1,4-二恶烷降解菌的检测方法，其特征在于，进行使用了1.所述的引物组的PCR法，根据是否发生基因扩增来判定是否存在具有thmC基因的微生物。3.一种1,4-二恶烷降解菌的定量方法，其特征在于，由通过使用了1.所述的引物组的实时PCR法所得的thmC基因的扩增量进行具有thmC基因的微生物的定量。通过本专利技术的引物组能够使thmC基因特异性地扩增，thmC基因被推定为是1,4-二恶烷降解菌所具有的参与1,4-二恶烷降解的基因，且编码属于构成THF单加氧酶的蛋白质之一的单加氧酶成分(Monooxygenasecomponent)MmoB/DmpM。通过thmC基因的扩增，可判定是否存在1,4-二恶烷降解菌。另外，从实时PCR法的Ct值能够高精度地推定样品中存在的1,4-二恶烷降解菌的菌体量。由于能够迅速且高精度地定量1,4-二恶烷降解菌的菌体量，故而如果菌体量少，则可迅速追加1,4-二恶烷降解菌，从而可稳定地维持1,4-二恶烷的处理能力。附图说明图1为D17株的定量监测系统的标准曲线。图2(A)为通过实时PCR法的定量值与浊度的相关关系，(B)为通过实时PCR法的定量值与通过直接计数法的定量值的相关关系。具体实施方式1,4-二恶烷降解菌(以下称为降解菌)存在于自然界，通过将被1,4-二恶烷污染的污泥等用仅含有1,4-二恶烷作为碳源的培养基培养从而可进行筛选。例如，作为降解菌已知有假诺卡氏菌属(Pseudonocardiasp.)D17、嗜二氯杂环己烷假诺卡氏菌(Pseudonocardiadioxani本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物组，其特征在于，由包含序列号：1记载的碱基序列的引物及包含序列号：2记载的碱基序列的引物构成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.24 JP 2015-1262021.一种引物组，其特征在于，由包含序列号：1记载的碱基序列的引物及包含序列号：2记载的碱基序列的引物构成。2.一种1,4-二恶烷降解菌的检测方法，其特征在于，进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：山本哲史，斋藤祐二，泷宽则，池道彦，黑田真史，清和成，井上大介，
申请(专利权)人：大成建设株式会社，国立大学法人大阪大学，学校法人北里研究所，
类型：发明
国别省市：日本,JP