用于检测靶核酸的高灵敏度方法技术

本文提供：一种能够抑制样品中的非靶核酸的核酸扩增和选择性地核酸扩增靶核酸的方法，其中在样品中混合存在大量的非靶核酸和罕见的靶核酸；一种用于以高灵敏度检测罕见突变基因的方法，所述方法组合该核酸扩增方法和用于检测靶核酸的特异性实时方法；以及一种用于该方法的组合物和试剂盒。

High sensitivity method for detecting target nucleic acid

This paper provides a method for selectively and nucleic acid can inhibit the non target nucleic acid in the sample and amplification of the target nucleic acid in the sample, which has a large number of mixed non target nucleic acid and rare target nucleic acid; for a rare mutant gene with high sensitivity detection method, the method of the combination of nucleic acid amplification method and a method for real-time detection of specific target nucleic acid; and a composition and a kit for the method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测靶核酸的高灵敏度方法
本专利技术涉及一种靶核酸的高灵敏度检测方法，其包括组合至少一种选择性抑制非靶核酸的核酸扩增的寡核苷酸和具有错配核酸内切酶活性的多肽。
技术介绍
已知有遗传性或后天性疾病与包括碱基置换、缺失和插入的基因突变有关。在这些突变中，某些突变与疾病直接相关和某些突变与疾病的风险和/或预后有关。在这些疾病中，对于随着疾病的进展而野生型基因变为突变型基因或具有突变型基因的细胞增加的疾病，检测突变型基因的存在是重要的。伴有基因突变的后天性疾病的实例和与疾病有关的基因突变的实例包括：肺癌和EGFR基因突变或K-ras基因突变；肺鳞状细胞癌和DDR2基因突变；结肠直肠癌和K-ras基因突变、PIK3CA基因突变或B-raf基因突变；及胃癌和Kit基因突变或PDGFR基因突变。也存在与上述的案例相反的情况。例如，在伴有基因突变的后天性疾病治疗过程中，监测到突变型基因减少和野生型基因增加。作为一个实例，提到微小残留病变的检测。作为一种分析基因突变的方法，限制性片段长度多态性方法(RFLP法)已被常规使用。然而，RFLP法需要繁琐操作和时间长。另外，依单核苷酸多态性(SNP)位点邻近的核苷酸序列而定，RFLP法可能不常应用。因此，已有人指出RFLP法对临床实验室使用存在许多问题。近年来，已开发了各种更简单和通用的方法，包括侵入物(Invader)法、TaqManPCR法、单碱基延伸法、焦磷酸测序(pyrosequencing)法和核酸外切酶循环试验法。然而，在使用常规PCR的情况下，当与野生型基因混合的少量突变型基因小于野生型基因量的5%时，在突变型基因的靶核酸达到可检出量之前扩增反应到达平台期，并且因此靶核酸不能完全检测。因此，PCR方法对检测作为靶核酸的突变型基因是一种非常有用的工具。然而，在PCR方法中，随着扩增产物的浓度增加，扩增产物的退火与引物退火之间竞争越来越激烈，并且最后引物不能退火且反应达到平台期。结果，含有SNP或短缺失或插入的靶核酸的扩增片段与大量过量存在的非靶核酸的扩增片段一同退火。因此，当扩增反应到达平台期时，靶核酸的扩增片段的丰度比降至低于反应开始之前的丰度比。因此，为了检测相同区域的少量SNP或缺失或插入，有必要自突变型基因特异性地扩增核酸，同时抑制野生型基因的核酸扩增。作为选择性扩增突变型基因的核酸同时抑制野生型基因的核酸扩增的方法的实例，富集PCR法(非专利文献1)和限制性核酸内切酶介导的选择性PCR方法(非专利文献2和3及专利文献1)已被报道。在这些方法中，在含有目标基因的突变位点核苷酸序列的引物中引入限制性内切酶的识别/切割位点，并从而选择性扩增突变型基因，同时抑制野生型基因的扩增。然而，这些方法需要选择能够识别和切割待分析的目标基因中的突变位点的限制性内切酶，并且另外，由限制性内切酶识别和切割的基因必须为野生型基因。另外，在PCR循环期间，限制性内切酶不得被灭活。存在的问题是只有有限的限制性内切酶满足这些要求，并且方法适用的对象野生型基因和突变型基因受限。作为另一种用于扩增野生型基因中核酸和突变型基因中核酸的方法，已建议用3’修饰的寡核苷酸进行突变体富集(MEMO)的方法(非专利文献4和专利文献2)。这种方法使用含有目标基因的突变位点的3’末端封端引物。3’末端封端引物的特征为与野生型基因100%匹配，而与突变型基因错配。通过使用3’末端封端引物，在野生型基因的核酸扩增中，用于扩增的引物退火和延伸受到抑制。另一方面，在突变型基因的核酸扩增中，由于突变型基因与3’末端封端引物之间错配而导致不稳定，因而不能抑制用于扩增的引物退火和延伸。结果，突变型基因的核酸扩增优先。方法中的检测通过解链曲线分析或测序实施。然而，该方法须使3’末端封端引物杂交，以致仅抑制野生型基因的引物延伸反应，并且要求在核酸扩增反应期间严格控制温度。另外，保持在初始样品中大量存在的野生型基因的初始量，并且不能减少野生型基因的核酸的意外扩增。最近几年，已经报道了包括使用耐热错配核酸内切酶(专利文献3)的突变检测方法。然而，为抑制野生型基因的核酸扩增并选择性扩增突变型基因以便仅正确检测突变型基因的存在，这些方法仍存在问题。文献列表专利文献专利文献1：WO1996/32500专利文献2：US2013/0149695A专利文献3：WO2014/142261非专利文献非专利文献1：Leukemia,第5卷第2期,第160-161页,1991.非专利文献2：Oncogene,第6卷,第6期,第1079-1083页,1991.非专利文献3：AmericanJournalofPathology,第153卷,第373-379页,1998.非专利文献4：TheJournalofMolecularDiagnostics,第13卷,第657-668页,2011。
技术实现思路
技术问题本专利技术的一个目的是提供一种相对于非靶核酸以很少量存在的靶核酸的高灵敏度检测方法。问题的解决方案本专利技术人分析了具有识别并切割错配位点的错配核酸内切酶活性的多肽性质，特别是错配的种类或位置和切割活性之间的相关性。结果，本专利技术人发现一种切割在其序列中至少一个碱基不同的两种核酸中任一种的方法，而不受不同碱基种类的限制。另外，本专利技术人发现一种选择性扩增罕见靶核酸的方法，其包括通过上述的切割方法处理含有大量非靶核酸和罕见靶核酸的混合物的样品，从而选择性切割非靶核酸，并因此使得能够选择性扩增靶核酸。另外，本专利技术人发现一种靶核酸的高灵敏度检测方法，其包括上述的核酸扩增方法。因此，本专利技术得以完成。具体地讲，本专利技术的第一方面涉及一种选择性切割在含有靶核酸和具有与靶核酸同源的核苷酸序列区域的非靶核酸的样品中的非靶核酸的方法，该方法包括使样品与以下接触的步骤：(i)寡核苷酸，当该寡核苷酸与非靶核酸杂交时其形成至少一个错配，和当该寡核苷酸与靶核酸杂交时，比该寡核苷酸与非靶核酸杂交时形成更多的错配；和(ii)具有错配核酸内切酶活性的多肽。在本专利技术的第一方面，非靶核酸通过碱基置换可具有与靶核酸的核苷酸序列不同的核苷酸序列，并且当寡核苷酸与非靶核酸杂交时寡核苷酸可形成至少一个错配，和当寡核苷酸与靶核酸杂交时可形成与所述至少一个错配对应的错配和至少另一个错配。进一步地，当寡核苷酸与非靶核酸杂交时寡核苷酸可形成一个错配，和当寡核苷酸与靶核酸杂交时可形成与所述一个错配对应的错配和另一个错配。进一步地，当寡核苷酸与靶核酸杂交时形成的两个错配优选地位置连续或间隔不超过5个碱基。在本专利技术第一方面的另一个实施方案中，非靶核酸通过碱基插入具有与靶核酸的核苷酸序列不同的核苷酸序列，并且当寡核苷酸与在非靶核酸中含有插入的区域杂交时，寡核苷酸形成至少一个错配。在另一个实施方案中，非靶核酸通过碱基缺失具有与靶核酸的核苷酸序列不同的核苷酸序列，并且当寡核苷酸与在非靶核酸含有缺失的区域杂交时，寡核苷酸形成至少一个错配。在本专利技术的第一方面，具有错配核酸内切酶活性的多肽可为源自耐热微生物的多肽或其突变体。另外，本专利技术可在酸性高分子物质存在下实施。进一步地，本专利技术可与增殖细胞核抗原(PCNA)的使用组合实施。本专利技术的第二方面涉及一种在含有靶核酸和具有与靶核酸同源的核苷酸序列区域的非靶核酸的样品中选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在含有靶核酸和具有与靶核酸同源的核苷酸序列区域的非靶核酸的样品中选择性切割非靶核酸的方法，所述方法包括使样品与以下接触的步骤：(i) 寡核苷酸，当所述寡核苷酸与非靶核酸杂交时其形成至少一个错配，和当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时，比所述寡核苷酸与非靶核酸杂交时形成更多的错配；和(ii) 具有错配核酸内切酶活性的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.20 JP 2015-0582701.一种在含有靶核酸和具有与靶核酸同源的核苷酸序列区域的非靶核酸的样品中选择性切割非靶核酸的方法，所述方法包括使样品与以下接触的步骤：(i)寡核苷酸，当所述寡核苷酸与非靶核酸杂交时其形成至少一个错配，和当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时，比所述寡核苷酸与非靶核酸杂交时形成更多的错配；和(ii)具有错配核酸内切酶活性的多肽。2.权利要求1的方法，其中非靶核酸通过碱基置换具有与靶核酸的核苷酸序列不同的核苷酸序列，并且当所述寡核苷酸与非靶核酸杂交时所述寡核苷酸形成至少一个错配，和当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时形成与所述至少一个错配对应的错配和至少另一个错配。3.权利要求2的方法，其中当所述寡核苷酸与非靶核酸杂交时所述寡核苷酸形成一个错配，和当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时形成与所述一个错配对应的错配和另一个错配。4.权利要求3的方法，其中当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时形成的两个错配位置连续或间隔不超过5个碱基。5.权利要求1的方法，其中非靶核酸通过碱基插入具有与靶核酸的核苷酸序列不同的核苷酸序列，并且当所述寡核苷酸与在非靶核酸中含有插入的区域杂交时，所述寡核苷酸形成至少一个错配。6.权利要求1的方法，其中非靶核酸通过碱基缺失具有与靶核酸的核苷酸序列不同的核苷酸序列，并且当所述寡核苷酸与在非靶核酸中含有缺失的区域杂交时，所述寡核苷酸形成至少一个错配。7.权利要求1-6中任一项的方法，其中具有错配核酸内切酶活性的多肽为源自耐热微生物的多肽或其突变体。8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述方法在酸性高分子物质存在下实施。9.一种在含有靶核酸和具有与靶核酸同源的核苷酸序列区域的非靶核酸的样品中选择性扩增靶核酸的方法，所述方法包括：(1)通过权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：上森隆司，相良武宏，井上晃一，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP