用于人脂肪基质细胞临床生长的细胞培养基的人血清制造技术

本发明专利技术涉及一种用于人类临床和治疗应用的用于人脂肪基质细胞临床生长的细胞培养基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于人脂肪基质细胞临床生长的细胞培养基的人血清相关申请的交叉引用本申请要求于2014年12月31日提交的美国临时专利申请No.62/098799的优先权，其全部内容并入本文。
本专利技术涉及一种用于人类临床和治疗应用的用于人脂肪基质细胞的临床生长的细胞培养基。
技术介绍
脂肪来源的干细胞，实际上，所有间充质干细胞被推测为血管周围的细胞，这意味着它们在遍及人体的血管附近生长。这可能表明ADSCs和MSCs习惯于“血性的”，富含血清的环境。据推测添加人血清将为这些细胞创造更自然的培养基。用全部人血清替代HAS(人血清白蛋白)也将大大降低培养基成本。现如今仍需要基于人体血清且商业上可行的干细胞培养基，以用于人脂肪基质细胞的生长。
技术实现思路
在第一个实施例中，本专利技术涉及一种用于人类临床和治疗应用的用于人脂肪基质细胞的临床生长的细胞培养基，所述培养基包括适合于哺乳动物细胞培养的基础培养基；不用抗凝血剂收集且在血清处理前允许血清凝块的人体血清；且包含(i)生长促进量的人胰岛素，(ii)人转铁蛋白，(iii)人重组表皮生长因子，(iv)人重组血小板衍生生长因子-BB，(v)碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)和(vii)酚红中的至少一种；其中所述培养基不含亚油酸。在另一个实施例中，本专利技术涉及一种制备用于人类临床和治疗应用的的用于人脂肪基质细胞的临床生长的细胞培养基的方法，包括以下步骤：将适合于哺乳动物细胞培养的基础培养基的成分进行组合；不用抗凝剂收集人血清，并在血清处理前允许其凝块；且包含(i)生长促进量的人胰岛素，(ii)人转铁蛋白，(iii)人重组表皮生长因子，(iv)人重组血小板衍生生长因子-BB，(v)碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)和(vii)酚红中的至少一种；其中所述培养基不含亚油酸。具体实施方式此处使用某些术语只是为了方便起见，并不是为了对本专利技术产生限制作用。所述术语包括特指的词，以及它们的衍生词和类似的外来词。本文讨论的实施例做不到全面详尽，也不会将本专利技术限制为本专利技术所述的准确形式。选择和以这种方式描述实施例都只是为了最好地解释该专利技术的原理，应用及实际运用，同时使该领域的技术人员能够最好地利用本专利技术。脂肪来源的干细胞及所有间充质干细胞被推测为血管周围的细胞，这意味着它们在遍及人体的血管附近生长。这可能表明ADSCs和MSCs习惯于“血性的”，富含血清的环境。本专利技术提供的细胞生长培养基中添加了人血清，人血清为这些细胞生长创造了一个更天然的培养基，同时还大大降低了培养基的成本。通常，血液都是通过在抗凝血剂存在的情况被收集，如EDTA或柠檬酸钠。因此，从该血液产生的“常规”血清可想而知具有所有正常凝血因子和与凝血相关的结构蛋白。这意味着，在正常血清中生长的细胞，可想到的是，最后都会覆盖凝血因子，所述凝血因子会导致在移植后的血液凝块。“脱落凝块”血清在不含抗凝血剂的情况下被收集，其在血清处理前可允许凝块。因此凝血因子将不在其中。使用人体血清的基本想法是利用以下原则：(i)MSCs(包括ADSCs)位于血管周围，意味着它们在遍及人体的血管附近生长。事实上，毛细血管所处的位置含有内皮细胞，所述内皮细胞上排列着毛细血管，并且MSCs直接位于内皮细胞的外面，这意味着，在整个生命过程中，MSCs将在血清存在的情况下存在，并且只存在于血清中。本领域的技术人员理解“合成培养基”的概念，例如所有物质都按已知的比例和数量进行添加。此外，本领域技术人员将认识到自然环境对于生长和维持这些细胞是最佳的。本专利技术添加了其他额外的生长因子如血小板衍生生长因子(PDGF)，上表皮生长因素(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF2)，目的是形成“增压的”或“增强的”人体血清，同时这也会促进MSCs在培养基中的生长。血清含有大量不同物质，其中许多物质并未被完全表征，而且其成分的独特组合形成了本专利技术所述的培养基。人血清白蛋白可用于本专利技术，然而，人血清白蛋白是血清中的大蛋白，许多物质，例如生长因子，特异性脂质，细胞因子等结合至所述大蛋白。人血清白蛋白是载体蛋白，在人血清白蛋白中看到的批次变化可能是由于与依附在上面的物质差异有关。不幸的是，人血清白蛋白价格昂贵且出现很多“批次”变化。人血清则更易获得，并且将包括人血清白蛋白没有的天然有益成分。来自健康个体的同种异体血清可能会对来自身体欠佳的人体的MSCs(间充质干细胞)产生积极影响。可以想到，针对具体患者的培养基可以在扩张过程中通过使用自体血清产生，使得该过程一直是自体同源的。因此，用户可以根据用途来选择同种异体或自体血清的基础培养基。如本文所提供的，在第一实施例中，本专利技术涉及一种用于人类临床和治疗应用的用于人脂肪基质细胞的临床生长的细胞培养基，所述培养基包括适合于哺乳动物细胞培养的基础培养基；不用抗凝剂收集的且在血清处理前允许凝块的人血清；和包括(i)生长促进量的人胰岛素，(ii)人转铁蛋白，(iii)人重组表皮生长因子，(iv)人重组血小板衍生生长因子-BB，(v)碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)和(vii)酚红中的至少一种；其中所述培养基不含亚油酸。本专利技术中的酚红含量比以前各代的培养基均低。本领域技术人员会理解，酚红是雌激素模拟物，并且希望可以减量使用。本文提供的群体倍增数在低氧环境中获得(5％，与正常环境空气的20％+对照)。该培养基的倍增数可超过40，甚至可以超过50。该培养基可以实现和维持18-20小时内倍增数为1的生长速率。该培养基有多能性，所述多能性被维持在至少35-37。在自发分化发生前，该培养基可以维持超过2个月的生长。与制备本领域已存在的培养基相比，本专利技术的培养基的成本大约降低了60％。有能力制备具有成本效益的培养基产品是培养基获取商业成功的核心，因此，才会有通过建立在当前培养基概念基础上获得改进的培养基实施例。基础培养基(细胞培养基：MCDB131：MCDB201和谷氨酰胺)的主要组分可以预先制成一种基础培养基，在实验室称作DMM。组分以“原始”形式获得(即冻干)，并重组形成所列出的物料浓度。下表列出了用OTC血清制备无异源脂肪来源的的干细胞培养基的组分的物料浓度，而不是最终浓度列表，包括：为了确保无菌性，所有组分按照列出的顺序依次加入到具有储液器(过滤器为0.22μm孔径和低结合(PES))的1000mL过滤器的上半部。完成的培养基保质期为3周，储存在冰箱(4-8℃)。各组分按以下方式存储为最佳：基础培养基，谷氨酰胺，ITSE，L-抗坏血酸-2-磷酸盐，2-巯基乙醇，地塞米松-冰箱(4-8℃)。OTC血清在-20℃或更冷的冷柜中，分装则保存在超低冷冻柜(-80±10℃)中。已制备生长因子，表皮生长因子，成纤维细胞生长因子-2，血小板衍生生长因子-BB储存在超低温冷冻柜中(-80±10℃)。本领域技术人员会认识到细胞在本专利技术的培养基中扩增前的收集、处理和储存的重要性。尤其，通过某一方法收集和消化细胞(必要时储存)又不失其本身特征和性质，如标记，以确保本专利技术的培养基的组分与用于扩增的细胞间产生相互作用。在本专利技术的培养基中扩增的细胞通过美国序列号No.13/646647中所述的方法从脂肪组织中处理，其全部内容已并入本文(AmericanCryostemCorporati本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于人类临床和治疗应用的用于人脂肪基质细胞临床生长的细胞培养基，所述培养基包括：一种适合哺乳动物细胞培养的基础培养基；不用抗凝剂收集且在血清处理前允许凝块的人血清；和(i)生长促进量的人胰岛素，(ii)人转铁蛋白，(iii)人重组表皮生长因子，(iv)人重组血小板衍生生长因子‑BB，(v)碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)和(vii)酚红中的至少一种；其中所述培养基不含亚油酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.31 US 62/098,7991.一种用于人类临床和治疗应用的用于人脂肪基质细胞临床生长的细胞培养基，所述培养基包括：一种适合哺乳动物细胞培养的基础培养基；不用抗凝剂收集且在血清处理前允许凝块的人血清；和(i)生长促进量的人胰岛素，(ii)人转铁蛋白，(iii)人重组表皮生长因子，(iv)人重组血小板衍生生长因子-BB，(v)碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)和(vii)酚红中的至少一种；其中所述培养基不含亚油酸。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的倍增数超过40甚至超过50。3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基可实现和维持在18-20小时倍增数为1的生长速率。4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，多能性被维持在至少35-37。5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，在分化发生前，维持细胞生长超过2个月。6.一种制备用于人类临床和治疗应用的用于人脂肪基质细胞临床生长的细胞培养基的方法，包括以下步骤：将适合于哺乳动物细胞培养的基础培养基的组分进行组合；不用抗凝剂收集人血清，在血...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·莫勒，
申请(专利权)人：迈克尔·莫勒，
类型：发明
国别省市：美国,US